Expansion och adipogenesinduktion av adipocytprogenitorer från perivaskulär adiposvävnad isolerad genom magnetiskt aktiverad cellsortering
Summary
Här redovisar vi en metod för isolering av Adipocyte Progenitor Cell (APC) populationer från perivaskulär adiposa vävnad (PVAT) med magnetisk aktiverad cellsortering (MCS). Denna metod möjliggör en ökad isolering av APC per gram fettvävnad jämfört med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
Abstract
Expansion av perivaskulär fettvävnad (PVAT), en viktig regulator av vaskulär funktion genom parakrin signalering, är direkt relaterad till utvecklingen av hypertoni under fetma. Graden av hypertrofi och hyperplasi beror på depåplats, kön och typen av adipocytprogenitorcell (APC) fenotyper närvarande. Tekniker som används för APC och preadipocytisolering under de senaste 10 åren har drastiskt förbättrat noggrannheten vid vilken enskilda celler kan identifieras baserat på specifika cellyta markörer. Isolering av APC och adipocyter kan dock vara en utmaning på grund av cellens bräcklighet, speciellt om den intakta cellen måste behållas för cellodlingsapplikationer.
Magnetiskt aktiverad cellsortering ( MCS) tillhandahåller ett sätt att isolera större antal livskraftiga APC per vikt enhet av fettvävnad. APC skördad av MCS kan användas för in vitro- protokoll för att expandera preaDipocyter och differentiera dem till adipocyter genom användning av tillväxtfaktor-cocktails som möjliggör analys av den produktiva och adipogena potentialen som behålls av cellerna. Detta experiment fokuserade på aorta och mesenteriska PVAT-depåer, vilka spelar nyckelroller vid utvecklingen av hjärt-kärlsjukdom under expansion. Dessa protokoll beskriver metoder för att isolera, expandera och differentiera en definierad APC-population. Detta MCS-protokoll tillåter isolering att användas i alla experiment där cellsortering behövs med minimal utrustning eller träning. Dessa tekniker kan hjälpa ytterligare experiment för att bestämma funktionaliteten hos specifika cellpopulationer baserat på närvaron av cellytmarkörer.
Introduction
Perivaskulär Adiposa Tissue (PVAT), på grund av dess närhet till blodkärl, är en viktig parakrin signaleringskomponent i vaskulärfunktion 1 . Expansion av denna fettvävnad är beroende av fenotypen hos adipocytprogenitorcellerna (APC) närvarande 2 , 3 . Isolering av celler från fettvävnad är svår eftersom primära adipocyter är bräckliga, flytande och varierar i storlek. Vissa isoleringstekniker kan också förändra cellfenotypen och morfologin genom att öka inflammatorisk proteinsyntes och reducera adipogen genuttryck 4 , vilket betonar vikten av ett protokoll som upprätthåller cellernas integritet.
Kulturen av primära celler och specifika preadipocyt-subpopuleringar ger en reduktivistisk inställning till in vivo tillväxt och upprätthåller ekvivalent cellulär genetisk smink 5 , även om man arbetar tiMig med dessa celler är begränsad på grund av försämring med åldrande eller senescence 6 . Preadipocyter från olika fett depåer, inklusive subkutana och omentala depåer, visar också skillnader i proliferation 7 , vilket betonar vikten av att samla celler från specifika anatomiska platser. Precursorceller från icke-PVAT vita adipos depot har karakteriserats i tidigare studier 7 , 8 , 9 , men mindre är känt om PVAT APC fenotyper.
De tekniker som beskrivs här möjliggör analysen av specifika och definierade APC-populationer med minimal inverkan på deras morfologi, livskraft och potential att proliferera och differentiera. Magnetiskt aktiverad cellsortering (MCS) är mottaglig för applikationer nedströms, såsom kultur, då pärlorna löser sig utan att förändra cellen. MCS är också ekonomiskt, och när antikroppen conCentrationer har standardiserats, behovet av flödescytometrianalyser är minimalt. In vitro- studier med PVAT-prekursorer kan också ge en glimt av den potential som dessa primära celler kan ha.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det centrala fokuset för föreliggande experiment är isoleringen, expansionen och adipogen induktion av APC från PVAT-depåer. Här presenterar vi ett protokoll för isoleringen av APC baserat på identifieringen av celler som uttrycker ytmarkörerna CD34 och PDGFRa. Dessa ytproteiner identifierades tidigare på APC med höga proliferationshastigheter och potentialen att differentiera i vita eller bruna adipocyter i olika adipos depots 14 , 15 . Genom att vä…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Contreras och Watts Laboratories och Dr. William Raphael. Dessa experiment stöddes av NHLBI F31 HL128035-01 (vävnadsdigestionsprotokoll standardisering), NHLBI 5R01HL117847-02 och 2P01HL070687-11A1 (djur) och NHLBI 5R01HL117847-02 (cellisolering och odling).
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. . in eLS. , (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
