Fødevarebårne patogen Screening ved hjælp af Magneto-fluorescerende Nanosensor: Hurtig påvisning af E. Coli O157: H7
Summary
Det overordnede mål med denne protokol er at syntetisere funktionelle sensorer på bærbar, omkostningseffektive, og hurtig påvisning af specifikt målrettet sygdomsfremkaldende bakterier gennem en kombination af magnetiske afslapning og fluorescens emission modaliteter.
Abstract
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 er blevet forbundet med både vandbårne og fødevarebårne sygdomme, og er stadig en trussel på trods af mad – og vand-screeningsmetoder bruges i øjeblikket. Mens konventionelle bakteriel påvisningsmetoder, såsom Polymerasekædereaktionen (PCR) og enzym-forbundet immunosorbent assays (ELISA) specifikt registrerer patogene stoffer, kræver de omfattende prøveforberedelsen og lange ventetider. Derudover disse praksis kræver avancerede laboratorieinstrumenter og indstillinger, og skal udføres af uddannede fagfolk. Heri, foreslås en protokol for en enklere diagnostisk teknik, der er udstyret med den unikke kombination af magnetiske og fluorescerende parametre i en nanopartikel-baseret platform. Den foreslåede multiparametric magneto-fluorescerende sensorer (MFnS) kan finde E. coli O157: H7 kontaminering med så lidt som 1 kolonidannende enhed i løsning inden for mindre end 1 time. Derudover MFnS evne til at forblive meget funktionelle i komplekse medier såsom mælk og søvand er blevet verificeret. Yderligere specificitet assays blev også brugt til at demonstrere evne til MFnS at kun opdage de specifikke målbakterierne, selv i nærværelse af lignende bakteriearter. Parring af magnetiske og fluorescerende modaliteter giver mulighed for påvisning og kvantificering af patogenet forurening i en bred vifte af koncentrationer, udstiller sine højtydende i både tidlige – og sene forurening påvisning. Effektivitet, overkommelighed og overførsel af MFnS gøre dem en ideel kandidat til punkt af pleje screening for bakterielle kontaminanter i en bred vifte af indstillinger, fra akvatiske reservoirer til kommercielt emballerede fødevarer.
Introduction
Den vedvarende forekomst af bakteriel forurening i både kommercielt fremstillede fødevarer og vandkilder har skabt et behov for mere og mere hurtig og specifik diagnostisk platforme. 1 , 2 nogle af de mere almindelige bakterielle kontaminanter ansvarlig for mad og vand kontaminering er fra Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus og Escherichia slægterne. 3 , 4 bakteriel forurening af disse patogener ofte resulterer i symptomer som feber, kolera, gastroenteritis, og diarré. 4 forurening af vandkilder ofte har drastiske og negative virkninger på Fællesskaber uden adgang til tilstrækkeligt filtreret vand, og forurening af fødevarer har ført til et stort antal sygdomme og produkt recall indsats. 5 , 6
For at mindske forekomsten af sygdomme forårsaget af bakteriel forurening, har der været en række bestræbelser på at udvikle metoder, som vand og fødevarer kan effektivt scannes før salg eller forbrug. 3 teknikker såsom PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 loop-medieret isotermisk forstærkning ( LAMPE),13,14 ,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 er for nylig blevet anvendt til påvisning af forskellige patogener. Sammenlignet med traditionelle bakteriel dyrkning metoder, er disse teknikker langt mere effektive med hensyn til specificitet og tid. Men disse teknikker stadig kamp med falske positiver og negativer, komplekse procedurer og omkostninger. 1 , 3 , 25 det er netop derfor at multiparametric magneto-fluorescerende sensorer (MFnS) er foreslået som en alternativ metode til registrering af bakteriel.
Disse sensorer par unikt sammen magnetiske afslapning og fluorescerende modaliteter, giver mulighed for en dobbelt-registrering platform, der er både hurtig og præcis. Ved hjælp af E. coli O157: H7 som prøve forurenende stof, er MFnS evne til at afsløre så lidt som 1 CFU inden for minutter påvist. Patogen-specifikke antistoffer bruges til at øge specificitet, og kombinationen af både magnetiske og fluorescerende modaliteter giver mulighed for påvisning og kvantificering af bakterielle kontaminanter i både lav – og høj-kontaminering intervaller. 16 for bakteriel forurening, vil sensorer sværmer omkring bakterier på grund af de målretning evner af patogen-specifikke antistoffer. Bindingen mellem den magnetiske sensorer og bakterier begrænser samspillet mellem den magnetiske jernkerne og de omkringliggende vand protoner. Dette medfører en stigning i T2 afslapning gange, som er registreret af en magnetisk relaxometer. Som koncentrationen af bakterier i løsning stiger, sprede sensorer med det øgede antal bakterier, resulterer i lavere T2 værdier. Omvendt, fluorescens emission vil stige i andelen med koncentrationen af bakterier på grund af det øgede antal sensorer direkte bundet til patogen. Centrifugering af prøverne, og isolering af den bakterielle pellet, vil kun spare nanopartikler direkte knyttet til bakterier, at fjerne enhver frit svævende sensorer, og direkte korrelerede fluorescens emission med antallet af bakterier er til stede i løsning. En skematisk gengivelse af denne mekanisme er repræsenteret i figur 1.
Denne MFnS platform er designet med punkt af pleje screening i tankerne, resulterer i lave omkostninger og bærbare egenskaber. MFnS er stabilt ved stuetemperatur, og er kun nødvendig i meget lave koncentrationer for nøjagtig påvisning af bakterielle kontaminanter. Desuden, efter syntese, brug af MFnS er enkel og kræver ikke brug af uddannede fagfolk på området. Endelig, denne diagnostiske platform giver mulighed for meget tilpasselig målretning giver dig mulighed for ved denne én platform kan bruges til at registrere patogener i alle former, i mange forskellige indstillinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol er blevet designet til at producere fuldt funktionel MFnS så enkelt som muligt. Men der er mange vigtige punkter hvor ændring af protokollen kan være nyttig, afhængigt af brugerens endelige mål. For eksempel, brug af forskellige antistoffer ville give mulighed for målretning af mange andre patogener. Desuden, er denne protokol ikke begrænset til brug af antistoffer som målretning molekyler. Ethvert molekyle, som har specifikke bindende affinitet for target patogener…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af K-INBRE P20GM103418, Kansas soja Kommissionen (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 og PSU polymer kemi start fond, alle SS. Vi takker Universitet Videograf, Mr. Jacob Anselmi, for hans fremragende arbejde med video. Vi takker også Mr. Roger Heckert og fru Katha Heckert for deres generøse støtte til forskning.
Materials
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
