مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الفحص باستخدام المغناطيسية-فلوري نانوسينسور: الكشف السريع عن O157:H7 كولاي
Summary
والهدف العام من هذا البروتوكول توليف nanosensors الفنية المحمولة، فعالة من حيث التكلفة، والموجهة خصيصا للكشف السريع عن البكتيريا المسببة للأمراض من خلال مزيج من الاسترخاء المغناطيسي وطرائق الانبعاثات الأسفار.
Abstract
ارتبط O157:H7 الإشريكيّة القولونية Enterohemorrhagic على حد سواء التي تنقلها المياه والأمراض المنقولة عن طريق الأغذية، وما زال يشكل تهديدا على الرغم من أساليب فحص الأغذية والمياه المستخدمة حاليا. بينما أساليب الكشف البكتيرية التقليدية، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) على وجه التحديد الكشف عن الملوثات المسببة للأمراض، أنها تتطلب إعداد عينة واسعة النطاق وفترات انتظار طويلة. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الممارسات تتطلب إعدادات وأدوات مختبرية متطورة، ويجب تنفيذها بواسطة مهنيين مدربين. هنا، يقترح وضع بروتوكول لأبسط تقنية تشخيص التي يتميز بمزيج فريد من المغناطيسية والفلورية المعلمات في منصة المستندة إلى نانوحبيبات. المقترح مولتيباراميتريك مغناطيسي-نيون nanosensors (مفنس) يمكن الكشف عن التلوث O157:H7 كولاي مع أقل قدر من 1 وحدة تشكيل مستعمرة في حل داخل ح أقل من 1. وعلاوة على ذلك، قدرة مفنس تبقى وظيفية للغاية في وسائل الإعلام المعقدة مثل الحليب، وتم التحقق من مياه البحيرة. واستخدمت أيضا فحوصات خصوصية إضافية لإثبات قدرة مفنس الكشف عن البكتيريا المستهدفة المحددة، حتى في وجود الأنواع البكتيرية مماثلة فقط. الاقتران من الطرائق المغناطيسية ونيون يسمح للكشف والتحديد الكمي للتلوث الممرض في طائفة واسعة من التركيزات، نستعرض أداء عالية في كلا الكشف المبكر والمتأخر من مرحلة التلوث. الفعالية والقدرة على تحمل التكاليف، وقابلية مفنس جعلها مرشح مثالي للعناية بنقطة الفرز للملوثات البكتيرية في مجموعة واسعة من الإعدادات، من الخزانات المائية للأطعمة المعلبة تجارياً.
Introduction
استمرار حدوث التلوث البكتيري في كل الأغذية المنتجة تجارياً، ومصادر المياه قد خلق حاجة إلى مناهج التشخيص متزايدة سريعة ومحددة. 1 , 2 بعض الملوثات البكتيرية أكثر شيوعاً المسؤولة عن تلوث الأغذية والمياه من أجناس السالمونيلا، المكوّرات العنقودية، الليستيريا، الضمة، ودوسنتاريا، عصية والاشريكيه. 3 , 4 التلوث البكتيري بمسببات هذه الأمراض غالباً ما ينتج عن أعراض مثل الحمى والكوليرا والتهاب المعدة والأمعاء والإسهال. 4 تلوث مصادر المياه في كثير من الأحيان قد آثار جذرية والضارة على المجتمعات المحلية دون الوصول إلى المياه التي تمت تصفيتها بما فيه الكفاية، وقد أدى تلوث الأغذية لعدد كبير من الأمراض والمنتج نذكر الجهود. 5 , 6
من أجل الحد من حدوث الأمراض الناجمة عن التلوث البكتيري، هناك عدد من الجهود الرامية إلى تطوير الأساليب التي الماء والغذاء يمكن أن تكون كفاءة الممسوحة ضوئياً قبل البيع أو الاستهلاك. 3 تقنيات مثل PCR،1،،من78،9،10 أليسا،11،(التضخيم متحاور بوساطة حلقة12 مصباح)،13،14 ، بين أمور أخرى،15،16،17،،من1819،،من2021، 22،،من2324 قد استخدمت مؤخرا للكشف عن مسببات الأمراض المختلفة. بالمقارنة مع التقليدية البكتيريا استزراع الأساليب، هذه التقنيات الآن أكثر كفاءة فيما يتعلق بخصوصية والوقت. ومع ذلك، هذه التقنيات ما زالت تكافح مع المغلوطة والسلبيات، وإجراءات معقدة وتكلفة. 1 , 3 , 25 لهذا السبب بالذات أن يقترح مولتيباراميتريك مغناطيسي-نيون nanosensors (مفنس) كطريقة بديلة للكشف عن البكتيريا.
هذه nanosensors فريد زوج معا الاسترخاء المغناطيسي وطرائق الفلورسنت، مما يسمح لمنصة مزدوجة-الكشف السريع والدقيق معا. استخدام O157:H7 كولاي كملوث عينة، ويظهر قدرة مفنس للكشف عن قدر ضئيل من 1 زيمبابوي في غضون دقائق. وتستخدم الأجسام المضادة الخاصة بالعوامل الممرضة لزيادة الدقة، ومزيج الطرائق المغناطيسية ونيون يسمح للكشف والتحديد الكمي للملوثات البكتيرية في نطاقات التلوث المنخفضة والعالية على حد سواء. 16 في حالة التلوث البكتيري، سوف سرب nanosensors حول البكتيريا بسبب استهداف قدرات الأجسام المضادة الخاصة بالعوامل الممرضة. الربط بين nanosensors المغناطيسي والبكتيريا يحد من التفاعل بين جوهر الحديد المغناطيسي والبروتونات المياه المحيطة بها. وهذا يؤدي إلى زيادة في أوقات الاسترخاء T2، كما سجلتها ريلاكسوميتير مغناطيسي. كما يرتفع تركيز البكتيريا في الحل، تفريق nanosensors مع العدد المتزايد من البكتيريا، أدى إلى انخفاض قيم T2. على العكس من ذلك، سيزيد انبعاث الأسفار بالتناسب مع تركيز البكتيريا، نظراً للعدد المتزايد من nanosensors ملزمة مباشرة للعوامل الممرضة. الطرد المركزي عينات، وعزل بيليه البكتيرية، إلا الحفاظ على جسيمات نانوية موصول مباشرة بالبكتيريا، وإزالة أي nanosensors التعويم الحر، وربط مباشرة انبعاث الأسفار مع العدد من البكتيريا الموجودة في الحل. ويمثل تمثيل تخطيطي لهذه الآلية في الشكل 1.
تم تصميم هذه المنصة مفنس مع فحص نقطة من الرعاية في الاعتبار، أسفر عن خصائص منخفضة التكلفة والمحمولة. مفنس مستقرة عند درجة حرارة الغرفة، ومطلوبة فقط بتركيزات منخفضة جداً لدقة الكشف عن الملوثات البكتيرية. وعلاوة على ذلك، بعد توليف، استخدام مفنس بسيطة ولا تتطلب استخدام مهنيين مدربين في المجال. أخيرا، يسمح هذا المنهاج التشخيص لاستهداف عالية للتخصيص، توفير وسيلة من ذلك يمكن استخدام منصة واحدة للكشف عن مسببات الأمراض بجميع أنواعها، في العديد من الإعدادات المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد صمم هذا البروتوكول لإنتاج مفنس تعمل بكامل طاقتها بساطة قدر الإمكان. ومع ذلك، هناك العديد من النقاط الرئيسية التي تحوير البروتوكول قد يكون من المفيد، اعتماداً على الهدف النهائي الخاص بالمستخدم. على سبيل المثال، سيتيح استخدام مختلف الأجسام المضادة لاستهداف العديد من …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل معتمد من قبل P20GM103418 إينبري ك وكانساس فول الصويا اللجنة (PSU أبيت/1663)، ACS PRF 56629-UNI7 الأمير سلطان البوليمر الكيمياء بدء تشغيل الصندوق، كل إلى SS. ونحن نشكر جامعة مصور فيديو، السيد جاكوب أنسيلمي، على عمله الممتاز مع الفيديو. كما نشكر السيد روجر هيكيرت والسيدة هيكيرت كاثا على دعمهم السخي للأبحاث.
Materials
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
