Foodborne Pathogen Screening met behulp van Magneto-belichting fluorescerende Nanosensor: Snelle detectie van E. Coli O157:H7
Summary
Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.
Abstract
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 is gekoppeld aan beide materialen op waterbasis en door voedsel overgedragen ziekten, en blijft een bedreiging ondanks de voedsel – en water-screeningmethoden die momenteel gebruikt. Terwijl conventionele bacteriële detectiemethoden, zoals polymerase-kettingreactie (PCR) en enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) specifiek pathogene contaminanten, kunnen detecteren vereisen ze uitgebreide monstervoorbereiding en lange wachttijden. Bovendien, deze praktijken eisen van geavanceerde laboratoriuminstrumenten en instellingen, en moeten worden uitgevoerd door daartoe opgeleide beroepsbeoefenaren. Hierin wordt een protocol voor een eenvoudiger diagnostische techniek die beschikt over de unieke combinatie van magnetische en fluorescerende parameters in een nanoparticle gebaseerde platform voorgesteld. De voorgestelde multiparametric magneto-belichting fluorescerende nanosensors (MFnS) kan detecteren E. coli O157:H7 besmetting met zo weinig als 1 kolonie-vormende eenheid aanwezig in oplossing binnen minder dan 1 uur. Bovendien, het vermogen van MFnS om te blijven hoogfunktionele in complexe media zoals melk en meerwater is geverifieerd. Extra specificiteit assays werden ook gebruikt om aan te tonen van het vermogen van MFnS om alleen de specifieke doelgroep bacteriën, zelfs in aanwezigheid van soortgelijke bacteriesoorten te detecteren. De koppeling van magnetische en fluorescerende modaliteiten zorgt voor de detectie en kwantificering van pathogen besmetting in een breed scala van concentraties, exposeren zijn hoge prestaties in beide vroege – en late-stadium besmetting detectie. De doelmatigheid, de betaalbaarheid en de overdraagbaarheid van de MFnS laten een ideale kandidaat voor point-of-care screening voor bacteriële contaminanten in een breed scala van instellingen, van aquatische reservoirs aan commercieel verpakte levensmiddelen.
Introduction
Het permanente exemplaar van bacteriële besmetting in zowel commercieel geproduceerd voedsel en waterbronnen heeft behoefte aan een steeds snelle en specifieke diagnostische platformen gemaakt. 1 , 2 zijn enkele van de meest voorkomende bacteriële verontreinigingen die verantwoordelijk zijn voor de verontreiniging van voedsel en water uit de Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus en Escherichia geslachten. 3 , 4 bacteriële besmetting door deze ziekteverwekkers vaak leidt tot symptomen zoals koorts, cholera, gastro-enteritis en diarree. 4 besmetting van waterbronnen vaak drastische en nadelige gevolgen heeft voor de Gemeenschappen zonder toegang tot voldoende gefilterd water en verontreiniging van levensmiddelen heeft geleid tot een groot aantal ziekten en product recall inspanningen. 5 , 6
Teneinde het ontstaan van ziekten veroorzaakt door bacteriële besmetting, zijn er een aantal inspanningen voor de ontwikkeling van methoden waarmee water en voedsel kunnen worden efficiënt gescand vóór de verkoop of het verbruik. 3 technieken zoals de PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 ()-lus-gemedieerde isotherme amplificatie LAMP),13,14 o.a.15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 onlangs zijn gebruikt voor de detectie van verschillende ziekteverwekkers. Vergeleken met traditionele bacteriële culturing methoden, zijn deze technieken veel efficiënter met betrekking tot de specificiteit en de tijd. Echter, deze technieken nog steeds worstelen met valse positieven en negatieven, ingewikkelde procedures en kosten. 1 , 3 , 25 het is om deze reden dat multiparametric magneto-belichting fluorescerende nanosensors (MFnS) worden voorgesteld als een alternatieve methode voor de detectie van bacteriële.
Deze nanosensors koppel uniek samen magnetische ontspanning en fluorescerende modaliteiten, waardoor voor een dual-detectie-platform dat is zowel snel als nauwkeurig. Met behulp van E. coli O157:H7 als een monster verontreinigingen, wordt het vermogen van MFnS om op te sporen zo weinig als 1 CFU binnen enkele minuten aangetoond. Pathogeen-specifieke antilichamen worden gebruikt om de specificiteit, en de combinatie van zowel magnetische als tl modaliteiten zorgt voor de detectie en kwantificering van bacteriële contaminanten in zowel laag – en hoog-besmetting bereiken. 16 in het geval van bacteriële besmetting, zal de nanosensors rond de bacteriën als gevolg van de targeting mogelijkheden van de pathogeen-specifieke antilichamen zwerm. De binding tussen de magnetische nanosensors en bacteriën beperkt de interactie tussen de magnetische ijzeren kern en het omringende water protonen. Dit veroorzaakt een toename in de T2 ontspanning tijden, zoals geregistreerd door een magnetische relaxometer. Als de concentratie van bacteriën in oplossing stijgt, wordt de nanosensors met het toegenomen aantal bacteriën, wat resulteert in lagere T2 waarden verspreiden. Omgekeerd, fluorescentie emissie zal toenemen in verhouding met de concentratie van bacteriën, als gevolg van het toegenomen aantal nanosensors direct gebonden aan pathogenen. Centrifugeren van de monsters, en isolatie van de bacteriële pellet, zal alleen de nanodeeltjes die rechtstreeks zijn verbonden met de bacteriën, een vrij zwevende nanosensors verwijderen en direct correleren de fluorescentie-uitstoot met het aantal besparen bacteriën aanwezig in oplossing. Een schematische weergave van dit mechanisme wordt afgebeeld in Figuur 1.
Dit MFnS-platform is ontworpen met point-of-care screening in het achterhoofd, wat resulteert in lage kosten en draagbare kenmerken. MFnS zijn stabiel bij kamertemperatuur, en alleen in zeer lage concentraties voor nauwkeurige detectie van bacteriële verontreinigende stoffen zijn verplicht. Bovendien, na synthese, gebruik van de MFnS is eenvoudig en vereist niet het gebruik van opgeleide professionals in het veld. Tot slot, dit diagnostische platform voorziet hoogst klantgerichte richt, zodat zij over een middel door welke dit één platform kan worden gebruikt voor het detecteren van ziekteverwekkers van alle soorten, in vele verschillende settings.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is ontworpen voor de productie van volledig functionele MFnS zo eenvoudig mogelijk. Echter, er zijn veel belangrijke punten waartegen de wijziging van het protocol nuttig zijn, afhankelijk van het einddoel van de gebruiker kunnen. Bijvoorbeeld, zou het gebruik van verschillende antilichamen voor het targeten van vele andere ziekteverwekkers. Bovendien, is dit protocol niet beperkt tot het gebruik van antilichamen als targeting moleculen. Een molecuul dat specifieke bindende a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de K-INBRE-P20GM103418, Kansas soja Commissie (KSC/PSU 1663), ACS PRF-56629-UNI7 en PSU polymeer chemie opstarten Fonds, alle aan SS. Wij danken de Universiteit videographer, Mr. Jacob Anselmi, voor zijn uitstekende werk met de video. Wij danken ook de heer Roger Heckert en Mrs. Katha Heckert voor hun gulle steun voor onderzoek.
Materials
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
