Patógeno de origem alimentar rastreio usando Nanosensor Magneto-fluorescente: Rápida detecção de Escherichia Coli O157: H7
Summary
O objetivo geral do presente protocolo é para sintetizar nanosensors funcional para o portátil, econômica, e rápida detecção de direcionado especificamente bactérias patogênicas através de uma combinação de relaxação magnética e as modalidades de emissão de fluorescência.
Abstract
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 tem sido associada a ambos de origem hídrica e doenças transmitidas por alimentos e continua a ser uma ameaça, apesar dos métodos de seleção de alimentos e de água usada atualmente. Enquanto os métodos de detecção bacteriana convencional, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e ensaios imunoenzimático (ELISA) especificamente podem detectar contaminantes patogênicos, eles exigem preparação da amostra extensa e longos períodos de espera. Além disso, estas práticas exigem instrumentos de laboratório sofisticado e configurações e devem ser executadas por profissionais treinados. Neste documento, propõe-se um protocolo para uma técnica de diagnóstica mais simples que apresenta uma combinação única de parâmetros magnéticos e fluorescentes em uma plataforma baseada em nanopartículas. O nanosensors de magneto-fluorescente Multiparamétrico proposto (MFnS) pode detectar a contaminação de Escherichia coli O157: H7 com tão pouco quanto 1 unidade formadoras presente em solução dentro de menos de 1 h. Além disso, a capacidade de MFnS permanecem altamente funcional em meios complexos tais como leite e água do lago foi verificada. Ensaios de especificidade adicionais também foram utilizados para demonstrar a capacidade de MFnS para detectar somente as bactérias do alvo específico, mesmo na presença de espécies bacterianas semelhantes. O emparelhamento de modalidades magnéticas e fluorescentes permite a detecção e quantificação de contaminação do patógeno em uma ampla gama de concentrações, exibindo seu alto desempenho em ambos deteção de contaminação e tarde-estágio inicial. A eficácia, acessibilidade e portabilidade dos MFnS torná-los um candidato ideal para o rastreio de point-of-care para bactérias contaminantes em uma ampla gama de configurações, de reservatórios aquáticos para alimentos embalados comercialmente.
Introduction
A ocorrência persistente de contaminação bacteriana em ambos produzidos comercialmente alimentos e fontes de água criou uma necessidade de plataformas de diagnósticos cada vez mais rápidas e específicas. 1 , 2 alguns dos contaminantes bacterianos mais comuns responsáveis pela contaminação de alimentos e água são dos gêneros Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus e Escherichia. 3 , 4 a contaminação bacteriana por esses patógenos frequentemente resulta em sintomas como diarreia, cólera, gastroenterite e febre. 4 contaminação das fontes de água, muitas vezes tem efeitos adversos e drásticos em comunidades sem acesso a água filtrada suficientemente, e contaminação de alimentos tem levado a um grande número de doenças e esforços de recuperação do produto. 5 , 6
A fim de reduzir a ocorrência de doenças causadas por contaminação bacteriana, tem havido uma série de esforços para desenvolver métodos pelos quais água e alimentos podem ser eficientemente verificados antes da venda ou consumo. 3 técnicas como a PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,(mediada por loop de amplificação isotérmica de12 LÂMPADA),13,14 entre outros,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 recentemente tem sido usado para detecção de vários patógenos. Comparado ao tradicional bacteriana, métodos de cultivo, estas técnicas são muito mais eficientes em relação à especificidade e tempo. No entanto, estas técnicas ainda lutam com falsos positivos e negativos, procedimentos complexos e custo. 1 , 3 , 25 … é por essa razão que Multiparamétrico magneto-fluorescente nanosensors (MFnS) propõem-se como um método alternativo para a deteção bacteriana.
Estes nanosensors com exclusividade par juntos relaxação magnética e modalidades fluorescentes, permitindo uma plataforma dual-deteção rápida e exata. Usando Escherichia coli O157: H7 como um contaminante de amostra, é demonstrada a capacidade de MFnS para detectar tão pouco quanto 1 CFU em poucos minutos. Específicas do patógeno anticorpos são usados para aumentar a especificidade, e a combinação de modalidades magnéticas e fluorescentes permite a detecção e quantificação de contaminantes bacterianos em ambas as gamas de alta e baixa –contaminação. 16 no caso de contaminação bacteriana, o nanosensors vai enxame à volta as bactérias devido as habilidades alvos dos anticorpos específicos do patógeno. A ligação entre a nanosensors magnética e bactérias limita a interação entre o núcleo de ferro magnético e os prótons de água circundante. Isto causa um aumento nos tempos de relaxamento T2, como registrado por uma relaxometer magnética. Como a concentração de bactérias na solução aumenta, os nanosensors se dispersar com o aumento do número de bactérias, resultando em valores mais baixos de T2. Por outro lado, a emissão de fluorescência aumentará em proporção com a concentração de bactérias, devido ao aumento do número de nanosensors diretamente ligado ao patógeno. Centrifugação das amostras e o isolamento da pelota bacteriana, só irão conservar as nanopartículas diretamente conectadas com as bactérias, removendo qualquer nanosensors flutuante e correlacionando diretamente a emissão de fluorescência com o número de bactérias presentes na solução. Uma representação esquemática deste mecanismo é representada na Figura 1.
Esta plataforma de MFnS foi projetada com rastreio de point-of-care em mente, resultando em características de baixo custo e portátil. MFnS são estáveis à temperatura ambiente e só são necessários em concentrações muito baixas para detecção precisa de bactérias contaminantes. Além disso, após a síntese, o uso da MFnS é simples e não requer o uso de profissionais treinados no campo. Por último, esta plataforma de diagnóstica permite direcionamento altamente personalizável, proporcionando um meio pelo qual este uma plataforma pode ser usada para detectar agentes patogénicos de todos os tipos, em muitas configurações diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo foi projetado para produzir MFnS totalmente funcionais como simplesmente possível. No entanto, existem muitos pontos-chave em que a alteração do protocolo pode ser útil, dependendo do objetivo do final do usuário. Por exemplo, o uso de anticorpos diferentes permitiria segmentação dos muitos outros patógenos. Além disso, este protocolo não é limitado ao uso de anticorpos como alvo moléculas. Qualquer molécula que tem afinidade de ligação específica para pató…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo K-INBRE P20GM103418, da Comissão de soja Kansas (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 e PSU polímero química inicialização, só para SS. Agradecemos a cinegrafista da Universidade, Sr. Jacob Anselmi, pelo seu excelente trabalho com o vídeo. Agradecemos também o Sr. Roger Heckert e Sra. Katha Heckert pelo seu generoso apoio para a investigação.
Materials
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
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