Livsmedelsburna patogener Screening med Magneto-fluorescerande Nanosensor: Snabb påvisande av E. Coli O157: H7
Summary
Det övergripande målet med detta protokoll är att syntetisera funktionella nanosensorer för bärbart, kostnadseffektiv och snabb påvisande av specifikt riktade patogena bakterier genom en kombination av magnetiska avkoppling och fluorescens utsläpp formerna.
Abstract
Entrohemoragiska Escherichia coli O157: H7 har kopplats till både vattenburen och livsmedelsburna sjukdomar och förblir ett hot trots de mat – och vatten-screeningmetoder används för närvarande. Medan konventionella bakteriell detektionsmetoder, såsom polymeras-kedjereaktion (PCR) och enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) kan särskilt upptäcka patogena föroreningar, kräver de omfattande provberedning och långa väntetider. Dessutom, dessa metoder kräver sofistikerade laboratorieutrustning och inställningar och måste utföras av utbildad personal. Häri, föreslås ett protokoll för en enklare diagnostisk teknik som erbjuder en unik kombination av magnetiska och fluorescerande parametrar i en nanopartikel-baserad plattform. Den föreslagna multiparametric magneto-fluorescerande nanosensorer (MFnS) kan upptäcka E. coli O157: H7 kontaminering med så lite som 1 kolonibildande enhet finns i lösning inom mindre än 1 h. Dessutom MFnS förmåga att förbli mycket funktionella i komplexa media såsom mjölk och sjövatten har verifierats. Ytterligare specificitet analyser användes också till att demonstrera möjligheten för MFnS att endast identifiera specifika bakterier, även i närvaro av liknande bakteriearter. Hopkoppling av magnetiska och fluorescerande formerna möjliggör detektering och kvantifiering av patogen förorening i ett brett utbud av koncentrationer, uppvisar sin höga prestanda i både tidigt och sent-stadium kontaminering upptäckt. Den effektivitet, överkomliga priser och portabilitet av MFnS gör dem en perfekt kandidat för point-of-care screening för bakteriella föroreningar i en mängd olika inställningar, från vattenlevande reservoarer för att kommersiellt förpackade livsmedel.
Introduction
Persistent förekomst av bakteriell kontamination i både kommersiellt producerad mat och vattentäkter har skapat ett behov av alltmer snabba och specifika diagnostiska plattformar. 1 , 2 några av de vanliga bakteriella föroreningarna som är ansvarig för mat och vatten förorening är från Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus och Escherichia släktena. 3 , 4 bakteriell kontamination av dessa patogener ofta resulterar i symtom såsom feber, kolera, gastroenterit och diarré. 4 förorening av vattentäkter ofta har drastiska och negativa effekter på samhällen utan tillgång till tillräckligt filtrerat vatten och livsmedelskontaminering har lett till ett stort antal sjukdomar och produkten recall ansträngningar. 5 , 6
För att minska förekomsten av sjukdomar som orsakas av bakteriell kontamination, har förekommit ett antal insatser för att utveckla metoder som vatten och mat kan effektivt skannas innan försäljning eller konsumtion. 3 tekniker såsom PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 loop-medierad isotermiska amplifiering ( LAMPA),13,–14 bland annat15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 har nyligen använts för olika patogener. Jämfört med traditionella bakteriell odling metoder, är dessa tekniker mycket effektivare när det gäller specificitet och tid. Dock kämpar dessa tekniker fortfarande med falska positiva och negativa, komplicerade förfaranden och kostnad. 1 , 3 , 25 det är denna anledning att multiparametric magneto-fluorescerande nanosensorer (MFnS) föreslås som en alternativ metod för bakteriell upptäckt.
Dessa nanosensorer para unikt ihop magnetiska avkoppling och fluorescerande modaliteter, möjliggör en dual-detection-plattform som är både snabb och noggrann. Med E. coli O157: H7 som en prov-förorening, demonstreras MFnS förmåga att upptäcka så lite som 1 CFU inom minuter. Patogen-specifika antikroppar används för att öka specificiteten och kombinationen av både magnetiska och fluorescerande formerna möjliggör detektering och kvantifiering av bakteriella föroreningar i både låg – och hög-förorening spänner. 16 när det gäller bakteriell kontamination, nanosensorer kommer att vimla runt bakterierna på grund av de inriktning förmågor av patogen-specifika antikroppar. Bindningen mellan magnetiska nanosensorer och bakterier begränsar samspelet mellan den magnetisk järnkärna och omgivande vatten protonerna. Detta orsakar en ökning i T2 avkoppling times, som registreras av en magnetisk relaxometer. När koncentrationen av bakterier i lösning stiger, skingra nanosensorer med det ökade antalet bakterier, vilket resulterar i lägre T2 värden. Omvänt, fluorescens utsläpp kommer att öka i proportion med koncentrationen av bakterier, på grund av det ökade antalet nanosensorer direkt bunden till patogen. Centrifugering av proverna och isolering av den bakteriella pelleten, kommer att endast bevara de nanopartiklar som direktansluten till bakterier, ta bort eventuella friflytande nanosensorer och direkt korrelera fluorescens utsläpp med antalet bakterier som finns i lösningen. En schematisk representation av denna mekanism är representerade i figur 1.
Denna MFnS plattform har utformats med point-of-care screening i åtanke, vilket leder till låg kostnad och bärbara egenskaper. MFnS är stabila i rumstemperatur och krävs endast i mycket låga koncentrationer för korrekt upptäckt av bakteriella föroreningar. Dessutom efter syntes, användning av MFnS är enkel och kräver inte användning av utbildad personal inom området. Avslutningsvis tillåter detta diagnostiska plattform för mycket anpassningsbara inriktning, att tillhandahålla ett sätt av som denna en plattform kan användas för att upptäcka patogener av alla slag, i många olika inställningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll har utformats för att producera fullt fungerande MFnS så enkelt som möjligt. Dock finns det många viktiga punkter som ändring av protokollet kan vara användbar, beroende på användarens slutmål. Exempelvis skulle användning av olika antikroppar möjliggöra för inriktning av många andra patogener. Dessutom är detta protokoll inte begränsat till användning av antikroppar som inriktning molekyler. Varje molekyl som har specifik affinitet för målpatogener, så…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av K-INBRE P20GM103418, Kansas sojabönor kommissionen (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 och PSU polymer kemi start fund, alla till SS. Vi tackar universitet videographer, Mr Jacob Anselmi, för hans enastående arbete med video. Vi tackar också Mr Roger Heckert och Mrs Katha Heckert för deras generösa stöd för forskning.
Materials
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
