胚胎运动神经元轴突投影模式的可视化<em>果蝇</em
Summary
这项工作详细描述了一个标准的免疫组织化学方法，可视化晚期16 号果蝇黑色素瘤胚胎的运动神经元投影。用FasII抗体染色的固定胚胎的切片制备提供了一个强大的工具，用于表征神经发育期间运动轴索寻路和靶标识别所需的基因。
Abstract
功能性神经肌肉回路的建立依赖于发育中的运动轴突和目标肌肉之间的精确连接。运动神经元通过响应大量来自周围细胞外环境的轴突指导线索，延长生长锥体以沿着特定途径导航。生长锥目标识别也在神经肌肉特异性中起关键作用。这项工作提出了一个标准的免疫组织化学方案，可视化晚期16 号果蝇黑色素瘤胚胎的运动神经元投影。该方案包括几个关键步骤，包括基因分型程序，以排序所需的突变体胚胎;免疫染色程序，用fasciclin II（FasII）抗体标记胚胎;和解剖程序，从固定胚胎产生鱼片制剂。周边的运动轴突突出物和肌肉图案在圆形胚胎的扁平制剂中比在wh中更好地可视化油籽胚胎。因此，用FasII抗体染色的固定胚胎的切片制备为表征运动轴突寻路和靶标识别所需的基因提供了有力的工具，也可以应用于功能丧失功能遗传屏障。
Introduction
胚胎发育期间运动轴突和目标肌肉之间的精确和选择性联系对于果蝇幼虫的正常运动是必不可少的 。每个腹部疾病A2-A7中的30个肌纤维的胚胎图案是由阶段16 1建立的 。在腹侧神经线中产生的36只运动神经元将其轴突延伸到外周以支配特定的目标肌肉2 。通过抗体（小鼠单克隆抗体1D4）3,4免疫组织化学可以观察到运动轴索寻路和靶标识别。在野生型胚胎中的运动轴突投影图案的多个图像可在网络5上获得 。 1D4抗体标记胚胎中枢神经系统（CNS）中线每侧的所有运动轴突和三个纵向轴突束</s， 6 （ 图1C和图2A ）。因此，FasII抗体的免疫组化提供了一个强大的工具，用于识别神经肌肉连接所需的基因，以证明运动轴突指导和靶标识别的分子机制。
在每个腹部A2-A7中，运动轴突突出并选择性地成形为两个主要神经分支，节段神经（SN）和节段间神经（ISN） 2,4和一个小神经分支，横向神经（TN ） 7 。 SN选择性地消弧以产生称为SNa和SNc的两个神经分支，而ISN分裂成称为ISN，ISNb和ISNd 2,4的三个神经分支。其中，ISN，ISNb和SNa运动轴突当晚期16期胚胎用FasII抗体染色时，投影图案最精确地可视化，并被切片（ 图1C和图2A ）。 ISN运动神经元延伸其轴突以支配1,2,3,4,9,10,11,18,19和20,2,4（ 图2A ）的背部肌肉。 ISNb运动神经元支配腹侧肌6,7,12,13,14,28和30,24（ 图2A和2B）。 SNa神经分支突出支配5,8,21,22,23和24,2,4（ 图2A ）的侧肌。由两个运动轴突组成的TN沿着节段边界向内侧投射以支配肌肉25，并且在侧向双极树突状神经元（LBD）中突触周边7 （ 图2A ）。这些目标肌肉神经支配不仅需要在特定选择点的运动轴突的选择性阻塞，而且还需要靶向肌肉识别。此外，在ISN和SNa途径中都发现了一些作为中间靶点的推定的中胚层路标细胞，但不是沿着ISNb途径4 。这可能表明与ISN和SNa运动轴突指导相比，ISNb运动轴索寻路可以以明显的方式进行调节，并且还表明外周运动轴突指导提供了一个有吸引力的实验模型来研究单个指导提示的差异或保守作用分子8 。
这项工作提出了一种标准方法，可视化果蝇中胚胎运动神经元的轴突投影模式。所描述的方案包括如何解剖用1D4a染色的固定胚胎在3,3'-二氨基联苯胺（DAB）中加工用于切片制剂。固定胚胎的扁平制剂的一个关键优点是周边轴突突起和肌肉模式的更好的可视化。此外，这项工作还显示了如何使用LacZ染色法将固定的胚胎基因型分类为所需的突变体胚胎。
Protocol
Representative Results
Discussion
运动轴突指导缺陷的细节通过DAB染色的胚胎的切片制备比通过荧光标记的激光扫描共焦显微镜更快，更准确。因此，固定和1D4染色的胚胎的切片制备最适合于指导提示分子的功能表征。指导线索包括网络，狭缝，信号素（Semas）和水母以及他们的同源受体在蠕虫，苍蝇和脊椎动物中具有进化上保守的作用。在作为狭缝受体的迂回（Robo）家族分子中， 果蝇 Robo在CNS 6,21中首先被确定为调解排?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我感谢Alex L. Kolodkin，因为我在他的实验室里学到了这个填写的准备方案。我也非常感谢杨宏宏的技术援助。本研究得到NRF-2013R1A1A4A01011329（SJ）的支持。
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
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