ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em> תסיסנית</em
Summary
עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.
Abstract
הקמת מעגלים neuromuscular תפקודית מסתמך על קשרים מדויקים בין פיתוח אקסונים המנוע השרירים היעד. נוירונים מוטוריים מרחיבים את קונוסים הצמיחה לנווט לאורך נתיבים ספציפיים על ידי תגובה למספר רב של רמזים הדרכה האקסון הנובעים מהסביבה החוץ תאיים שמסביב. זיהוי קונוס יעד הכרה גם משחק תפקיד קריטי neuromuscular הספציפיות. עבודה זו מציגה פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי לדמיין תחזיות נוירון המנוע של מאוחר בשלב 16 תסיסנית עוברי melanogaster . פרוטוקול זה כולל כמה שלבים עיקריים, כולל הליך genotyping, כדי למיין את העוברים מוטציה הרצוי; הליך immunostaining, כדי לתייג עוברי עם פאסיקלין II (FasII) נוגדן; ו הליך לנתיחה, כדי לייצר ההכנות filleted מעוברים קבועים. תחזיות האקסון מוטוריים דפוסי שרירים בפריפריה הם דמיינו הרבה יותר טוב בהכנות שטוחות של עוברים filleted מאשר whOLE-mount עוברי. לכן, הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתם נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה כדי לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון pathfinding וזיהוי היעד, וזה יכול להיות מיושם גם אובדן של פונקציה ואת הרווח של תפקוד גנטי מסכי .
Introduction
חיבורים מדויקים וסלקטיביים בין אקסונים המנוע ושרירי היעד במהלך התפתחות עובריים חיוניים לתנועה רגילה בזחלים תסיסנית . דפוס עוברי של 30 סיבי שריר בכל אחת hemisements הבטן A2-A7 הוקמה על ידי שלב 16 1 . 36 נוירונים המוטוריים הנוצרים חוט העצבים הגחון להרחיב את האקסונים שלהם לתוך הפריפריה כדי innervate מטרה ספציפית השרירים 2 . מנוע pathoninding האקסון וזיהוי היעד יכול להיות דמיינו על ידי אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן (נוגדנים עכבר חד שבטיים 1D4) 3 , 4 . תמונות מרובות של דפוסי המנוע האקסון היטל בעוברים wildtype זמינים באינטרנט 5 . תווית 1D4 תוויות כל אקסונים המנוע שלושה קווים האקסון האורך על כל צד של קו האמצע של מערכת העצבים המרכזית העצבית (CNS) 4 </sUp> , 6 ( איור 1C ו איור 2 א ). לכן, אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים FasII מספק כלי רב עוצמה לזיהוי גנים הדרושים עבור קישוריות neuromuscular להפגין את המנגנונים המולקולריים בבסיס הדרכה האקסון המנוע ואת ההכרה היעד.
בכל אחד מההתעמלות הבטן A2-A7, פרוייקט האקסונים המוטוריים, ונסלק באופן סלקטיבי לשני ענפים עצביים עיקריים, העצב הסגמנטלי (SN) והעצב הבין-גופי (ISN) , 2 , 4 וענף עצבים קטן, העצב הרוחבי (TN ) 7 . ה- SN מבטל באופן סלקטיבי ליצור שני ענפים עצביים הנקראים SNa ו- SNC, בעוד שה- ISN מתחלק לשלושה ענפים עצביים הנקראים ISN, ISNb ו- ISNd 2 , 4 . ביניהם, ISN, ISNb, ו SNA המנוע האקסוןדפוסי הקרנה הם דמיינו במדויק כאשר בשלב מאוחר 16 עוברי מוכתמים נוגדן FasII והם filleted ( איור 1C ו איור 2 א ). נוירונים המנוע ISN להרחיב את האקסונים שלהם innervate שרירי הגב 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19, ו 20 2 , 4 ( איור 2 א ). הנוירונים המנוע ISNb innervate השרירים ventrolateral 6, 7, 12, 13, 14, 28, ו 30 2 , 4 ( איור 2 א ו -2 ב). הענף SNa עצב פרויקטים innervate השרירים לרוחב 5, 8, 21, 22, 23, ו 24 2 , 4 ( איור 2 א ). TN, אשר מורכב משני אקסונים המנוע, פרויקטים ipsilaterally לאורך הגבול המגזרי כדי innervate שריר 25 ועושה סינפסות עם נוירון דנדריטי דו קוטבית לרוחב (LBD) בפריפריה 7 ( איור 2 א ). אלה entervations שרירים היעד דורשים לא רק defasciculation סלקטיבי של אקסונים המנוע בנקודות בחירה ספציפיות, אלא גם לכוון הכרה שריר. בנוסף, חלק מהמסלולים של ה- ISN ו- SNa, אך לא לאורך מסלול ISNb. זה עשוי להצביע על כך ISNb המנוע axon pathfinding יכול להיות מוסדר באופן שונה לעומת ISN ו SNA המנוע האקסון הדרכה, והוא גם מציין כי ההנחיה האקסון המנוע ההיקפי מספק מודל ניסיוני אטרקטיבי ללמוד את ההפרש או שימור תפקידים של רמז הדרכה אחת מולקולה 8 .
עבודה זו מציגה שיטה סטנדרטית כדי לדמיין את דפוסי היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים תסיסנית . הפרוטוקולים המתוארים כוללים כיצד לנתח עוברי קבוע מוכתם 1D4 אNtibody ומעובד ב -3.3 'diaminobenzidine (DAB) להכנת ההכנות. יתרון קריטי אחד של ההכנות השטוח של עוברי קבוע הוא הדמיה טובה יותר של תחזיות axonal ודפוסי שרירים בפריפריה. יתר על כן, עבודה זו גם מראה כיצד גנוטיפ עוברי קבוע כדי למיין את העוברים מוטציה הרצוי באמצעות שיטת מכתים LacZ.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרטים של פגמים ההנחיה האקסון המנוע הם הבקיע מהר יותר עם דיוק טוב יותר על ידי הכנת filleted של עוברי DAB מוכתם מאשר על ידי לייזר סריקה מיקרוסקופיה confocal של אלה שכותרתו fluorescently. לכן, הכנת filleted של עוברי קבוע 1D4 מוכתם הוא המתאים ביותר עבור אפיון פונקציונלי של מולקולות הדרכה cue. א?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אני מודה לאלכס ל. קולודקין, כפי שלמדתי את פרוטוקול הכנת הפרוזה במעבדה שלו. אני גם מודה יאנג הונג הונג על סיוע טכני. מחקר זה נתמך על ידי NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
References
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- . Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017)
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
