Visualisering av Axonal Projeksjonsmønsteret av Embryoniske Motor Neuroner i<em> Drosophila</em

Summary

Dette arbeidet beskriver en standard immunhistokjemi metode for å visualisere motor neuron projeksjoner av sent stadium-16 Drosophila melanogaster embryoer. Det fileterte preparatet av faste embryoer farget med FasII antistoff gir et kraftig verktøy for å karakterisere de gener som kreves for motorisk aksonopplæring og målgjenkjenning under nevrale utvikling.

Abstract

Etableringen av funksjonelle nevromuskulære kretser er avhengig av nøyaktige forbindelser mellom utviklende motoraxoner og målmuskler. Motorneuroner forlenker vekstkegler for å navigere langs bestemte veier ved å svare på et stort antall aksonveiledningsanvisninger som stammer fra det omgivende ekstracellulære miljøet. Vektkegle-målgjenkjenning spiller også en kritisk rolle i nevromuskulær spesifisitet. Dette arbeidet presenterer en standard immunhistokjemi protokoll for å visualisere motor neuron projeksjoner av sent stadium-16 Drosophila melanogaster embryoer. Denne protokollen inneholder noen få viktige trinn, inkludert en genotyping-prosedyre, for å sortere de ønskede mutantembryonene; En immunfremmende prosedyre for å merke embryoer med fasciclin II (FasII) antistoff; Og en disseksjonsprosedyre for å generere fileterte preparater fra faste embryoer. Motoraxonprojeksjoner og muskelmønstre i periferien er mye bedre visualisert i flate preparater av fileterte embryoer enn i whOle-mount embryoer. Derfor fyller det fileterte preparatet av faste embryoer som er farget med FasII-antistoff et kraftig verktøy for å karakterisere de gener som kreves for motorisk aksonoppfylling og målgjenkjenning, og det kan også brukes på både funksjonstabell og genetisk skjermforsterkning .

Introduction

Nøyaktige og selektive forbindelser mellom motorakser og målmuskler under embryonisk utvikling er avgjørende for normal fremdrift i Drosophila larver. Den embryonale mønsteret på 30 muskelfibre i hver av bukhemisegmentene A2-A7 er etablert ved trinn 16 ¹ . De 36 motorneuronene som genereres i den ventrale nerve ledningen, strekker deres axoner i periferien til å innervate bestemte målmuskler ² . Motoraksonbanevinding og målgjenkjenning kan visualiseres ved immunhistokjemi med et antistoff (musmonoklonalt antistoff 1D4) ^{3 , 4} . Flere bilder av motoraxonprojeksjonsmønstrene i wildtype-embryoer er tilgjengelige på nettet ⁵ . 1D4-antistoffet merker alle motoraxoner og tre langsgående aksonfasikaler på hver side av midterlinjen av det sentrale nervesystemet (CNS) ⁴ </sOpp> ^{, 6} ( figur 1C og figur 2A ). Derfor gir immunhistokjemi med FasII antistoff et kraftig verktøy for å identifisere gener som kreves for nevromuskulær tilkobling for å demonstrere molekylære mekanismer som ligger bak motorisk aksonveiledning og målgjenkjenning.

I hver av de abdominale hemisegmentene A2-A7, motoriske aksonsprosjektet og selektivt fasciculerer i to hovednerven, er segmentnerven (SN) og den intersegmentelle nerven (ISN) ^{2 , 4} og en mindre nervegren, den transversale nerveen (TN ) ⁷ . SN-selektivt defasciculates for å gi opphav til to nervegrener kalt SNa og SNc, mens ISN deler seg i tre nervegrener kalt ISN, ISNb og ISNd ^{2 , 4} . Blant dem, ISN, ISNb og SNa motor axonProjeksjonsmønstre blir mest nøyaktig visualisert når sent stadium 16 embryoer farves med FasII antistoff og er filetert ( figur 1C og figur 2A ). ISN-motorneuronene forlenker deres aksoner til indre dorsale muskler 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 og 20 ^{2 , 4} ( figur 2A ). ISNb-motorneuronene innerverer ventrolaterale muskler 6, 7, 12, 13, 14, 28 og 30 ^{2 , 4} ( figur 2A og 2B). SNa-nervegrenen prosjekterer å innervate laterale muskler 5, 8, 21, 22, 23 og 24 ^{2 , 4} ( figur 2A ). TN, som består av to motoraxoner, prosjekterer ipsilateralt langs segmentgrensen til innervate muskel 25 og gjør synapser med den laterale bipolære dendritiske nevronen (LBD) iPeriferien ⁷ ( figur 2A ). Disse målmuskulaturinnervasjonene krever ikke bare selektiv defaskulering av motoraxoner på bestemte valgpunkter, men også målrettet mot muskelgjenkjenning. I tillegg er det funnet noen formodede mesodermale guidepostceller som fungerer som mellommål i både ISN og SNa-veiene, men ikke langs ISNb-vei ⁴ . Dette kan tyde på at ISNb-motorisk aksonopplæring kan reguleres på en tydelig måte i forhold til ISN- og SNa-motor-aksonveiledning, og det indikerer også at perifer motorisk axon-veiledning gir en attraktiv eksperimentell modell for å studere differensialet eller konserverte roller i en enkelt veilednings-cue Molekyl ⁸ .

Dette arbeidet presenterer en standard metode for å visualisere de aksonale projeksjonsmønstrene av embryonale motorneuroner i Drosophila . De beskrevne protokollene inkluderer hvordan man dissekerer faste fostre farget med 1D4 aNtibody og behandlet i 3,3'-diaminobenzidin (DAB) for fileterte preparater. En kritisk fordel ved de flate preparatene av faste embryoer er den bedre visualiseringen av de aksonale fremspringene og muskelmønstrene i periferien. Videre viser dette arbeidet også hvordan man genotype faste embryoer for å sortere de ønskede mutantembryonene ved hjelp av LacZ-farvemetoden.

Protocol

1. Fremstilling Tilbered 500 ml fosfatbuffert saltvann (PBS) med t-oktylfenoksypolyetoksyetanol (PBT) oppløsning ved å tilsette 0,5 g okseserumalbumin (BSA) og 0,5 ml t-oktylfenoksypolyetoksyetanol (se tabell over materialer) til 500 ml 1X PBS Og omrøring i minst 30 minutter. Oppbevares ved 4 ° C. Bruk når det er relativt friskt og oppbevar løsningen i en ren flaske. Lag 10 ml 4% paraformaldehyd ved å tilsette 2,5 ml 16% stock paraformaldehydoppløsning og 1 ml 10x PBS til 6,5 ml deionisert v…

Representative Results

Nøyaktige forbindelser mellom motoraxoner og målmuskler under nevrale utviklingen er avhengig av selektiv aksonaxonavstøtning og målgjenkjenning ved bestemte valgpunkter 4 . I Drosophila er selektiv avstengning mellom motoraxoner regulert delvis av den kombinerte virkningen av klasse 1 og 2 semaforer (Semas), inkludert Sema-1a, Sema-2a og Sema-2b 8 , 14 , 15 …

Discussion

Detaljer om motorisk aksonstyringsfeil blir scoret raskere og med bedre nøyaktighet ved den fileterte fremstilling av DAB-farget embryoer enn ved laserskanning av konfokal mikroskopi av fluorescensmerkede. Derfor er det fileterte preparatet av faste og 1D4-fargede embryoer best egnet for funksjonell karakterisering av veiledningsøkemolekyler. Fire hovedklasser av veiledningsanvisninger, inkludert netrins, Slits, semaforiner (Semas) og ephrins, og deres kognitive reseptorer har evolusjonært bevart roller over ormer, f…

Materials

Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)