Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn
Summary
Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.
Abstract
In dieser Studie beschreiben wir eine abgekürzte Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn. Das Ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) solubilisiert effektiv nativ gefaltete Proteine im Gehirngewebe, so dass die Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate aus einer breiten Palette von neurodegenerativen Proteinopathies, wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson und Amyotrophe Lateralsklerose und Prion-Krankheiten. Menschlichen Kontrolle und Post-mortem Hirngewebe AD wurden homogenisiert und sedimentierte durch Ultrazentrifugation in Anwesenheit von Sarkosyl Waschmittel-unlösliche Aggregate einschließlich pathologischer phosphorylierten Tau, das Herzstück der neurofibrillären bereichern Verwicklungen in AD. Westliche Beflecken, demonstriert die differenzielle Löslichkeit der aggregierten phosphoryliert-Tau und die Waschmittel-lösliche Protein, frühen Endosom Antigen 1 (EEA1) in Steuerung und AD Gehirn. Proteomic Analysen ergaben auch Bereicherung der β-Amyloid (Aβ), Tau, snRNP70 (U1 – 70 K), und Apolipoprotein E (APOE) in die Sarkosyl-unlösliche Bruchteilen von AD Gehirn im Vergleich zu denen der Kontrolle, konsistent mit früheren Gewebe Fraktionierung Strategien . Somit eignet sich dieses einfache Bereicherung-Protokoll für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und funktionsfähiges Protein Co Aggregation Assays, Massenspektrometrie-basierte Proteomics.
Introduction
Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und die eng verwandten Prion-Krankheiten sind gekennzeichnet durch die allmähliche Anhäufung von proteinopathies Waschmittel-unlösliche Aggregate im Gehirn mit begleitenden kognitiven ablehnen. 1 , 2 diese gemeinsame pathologische Funktion wird gedacht, um eine zentrale Rolle in der Ätiologie und Pathophysiologie dieser neurodegenerativen Krankheiten. 2 diese Aggregate bestehen typischerweise aus Polymeren Amyloid Fasern, die zusammengesetzt sind, sich wiederholender Einheiten der fehlgefaltete Protein ausstellenden Kreuz β-Struktur. 1 , 2 , 3 , 4 biochemisch, Amyloid Aggregate sind sehr widerstandsfähig gegen chemische oder thermische Denaturierung und Solubilisierung,3 stellt besondere Herausforderungen an ihre Reinigung, Analyse und über traditionelle biochemischen Techniken zu studieren. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 es überrascht nicht, wurde die Waschmittel-unlösliche Proteinfraktion viel Forschungsschwerpunkt in der Pathophysiologie der neurodegenerativen Erkrankungen mit der Anhäufung von fehlgefaltete Proteine. 6 , 12 , 13 , 14
Biochemische Fraktionierung Techniken wurden oft genutzt, um die Reinigungsmittel-unlösliche Fraktion aus Post-mortem Gehirn Homogenates bereichern. 6 , 12 , 13 , 14 eine der am häufigsten verwendeten Methoden beinhaltet die sequentielle Extraktion von Gewebe Homogenates mit Puffern und Reinigungsmittel erhöhen Stringenz, gefolgt von Ultrazentrifugation, die löslichen und unlöslichen Anteile zu partitionieren. Eine häufig verwendete sequentielle Fraktionierung Protokoll6,14 beinhaltet die Homogenisierung der gefrorene Gewebeproben in einem Waschmittel-freie wenig Salz (LS)-Puffer und die daraus resultierende unlösliche Pellets werden dann nacheinander mit extrahiert Puffer mit hohen Salz, nichtionischen Detergentien, hohen Saccharose, wie Ionischen Detergentien und schließlich Chaotropes Harnstoff. 6 , 14 eine offensichtliche Nachteil solch eine sequentielle Fraktionierung Protokolle ist die beträchtliche Zeit und Arbeit Engagement erforderlich, um sie abzuschließen. Einschließlich der Homogenisierung und Ultrazentrifugation, eine typische 5-stufige Fraktionierung Protokoll dauert mehrere Stunden oder sogar Tage dauern. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 darüber hinaus möglichst viele pathologische Proteinaggregaten unlöslich in allen außer den härtesten Bedingungen19,20 bleiben die meisten der erzeugten Brüche sind nur von begrenztem Wert. Somit sind die weniger strengen Fraktionierung Schritte nutzen hohe Salzkonzentrationen und nichtionische Detergentien weitgehend überflüssig.
Frühere Studien haben gezeigt, dass die ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) ein ausgezeichneter Kandidat für einen vereinfachten einstufigen Waschmittel Fraktionierung Protokoll ist. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 als denaturierenden Waschmittel, Sarkosyl ist streng genug, um die überwiegende Mehrheit der nativ gefaltete Proteine im Gehirn anderweitig ohne Gefäss-fehlgefaltete Protein-Aggregate bestehend aus Beta-Amyloid (Aβ),6,11 phosphorylierten Tau (pTau),6 TAR DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43),14 Alpha-Synuclein,12,13 Scrapie,23 oder U1 small nuclear Ribonucleoproteins (U1 SnRNPs) wie U1 – 70 K. 5 , 21 , 22 Da Sarkosyl weniger streng als die allgegenwärtigen anionische Detergenzien Dodecyl Natriumsulfat (SDS) ist, bewahrt es weniger robuste Oligomere Formen von fehlgefaltete Protein-Aggregate, die SDS-Behandlung nicht standhalten können. 9
Zuvor beschrieben wir eine abgekürzte Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, das vergleichbar mit aufwendiger sequentielle Fraktionierung Methoden Ergebnisse erzielt. 5 durch die weniger strenge Fraktionierung Schritte auslassen, konnten wir ein facile Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn zu entwickeln. 5 dieses ausführliche Protokoll beschriebenen eignet sich gut für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und Massenspektrometrie-basierte Proteomics, funktionsfähiges Protein misfolding und Aggregation seeding assays. 5 , 6 , 21
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wir vorstellen und diskutieren eine abgekürzte Einzelschritt Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, die für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen von Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen bis hin zu funktionellen Protein misfolding assays und westliche Beflecken. 5 , 6 , 7 , 10 dieser Methodik ist vielleicht die meisten wirksam, wenn Sie zur Untersuchung neurodegenerati…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Jim Lah und Allan Levey, Emory Universitätsklinik für Neurologie, für die hilfreichen Kommentare und Anregungen. Diese Arbeit wurde teilweise finanziert durch die Beschleunigung der Medizin Partnerschaft Grant (U01AG046161-02), die Emory Alzheimer Disease Research Center (P50AG025688) und eine National Institute on Aging gewähren (R01AG053960-01) N.T.S. Diese Forschung wurde auch teilweise durch die Neuropathologie Kern von Emory Neurowissenschaften NINDS Core Facilities Grant, P30NS055077 unterstützt.
Materials
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| 1.5 ml polypropylene Pellet Pestle | Kimble Chase | 749521-1500 | homogenization tool |
| cordless motor for Pellet Pestle | Kimble Chase | 749540-0000 | homogenization tool |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
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