Un protocole de fractionnement abrégée pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain est décrite.
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Article de méthode
Enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole abrégée seule étape fractionnement pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau humain de post-mortem. Le détergent ionique N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) solubilise efficacement les protéines nativement repliées dans le tissu cérébral, ce qui permet l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent parmi un large éventail de proteinopathies neurodégénératives, telles que La maladie d’Alzheimer (ma), la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique et maladies à prions. Contrôle de l’homme et les tissus du cerveau post-mortem AD ont été homogénéisés et sédimentée par ultracentrifugation en présence de sarkosyl pour enrichir les agrégats de protéines insolubles dans un détergent dont la protéine tau phosphorylée pathologique, le composant principal d’enchevêtrements enchevêtrements dans AD. Western blot ont démontré la solubilité différentielle des agrégés-tau phosphorylée et la protéine soluble dans un détergent, Endosome précoce Antigen 1 (EEA1) dans le contrôle et le cerveau. Analyse protéomique a également révélé l’enrichissement des β-amyloïde (Aß), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) et de l’apolipoprotéine E (APOE) dans les fractions sarkosyl insoluble du cerveau par rapport à celles du contrôle, compatible avec les stratégies précédentes de fractionnement tissulaire . Par conséquent, ce protocole simple enrichissement est idéal pour un large éventail d’applications expérimentales allant de Western Blot et protéine fonctionnelle épreuves agrégation Co à basé sur la spectrométrie de masse protéomique.
Introduction
Les maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH), sclérose latérale amyotrophique (SLA) et les maladies de prion étroitement apparentées sont proteinopathies caractérisée par l’accumulation progressive de agrégats de protéine insoluble dans le détergent dans le cerveau avec accompagnement cognitives déclinent. 1 , 2 cette caractéristique pathologique partagée est censée jouer un rôle central dans l’étiologie et la physiopathologie de ces maladies neurodégénératives. 2 ces agrégats sont composés de polymères fibres a....
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Protocole
déclaration d’éthique : tous les tissus du cerveau ont été extraites de l’Emory Alzheimer ' s Disease Research Center (ADRC) Banque de cerveaux. Des tissus post-mortem humains ont été acquis en vertu de protocoles appropriés de Institutional Review Board (IRB).
1. homogénéisation et fractionnement
- sélection de tissu
Remarque : Frozen tissus post-mortem de cortex frontal de contrôle sain (Ctl) et pathologiquement AD confirmés ont été sélectionnés parmi la Emory Banque de cerveaux ADRC (n = 2). Évaluation neuropathologique post-mortem de la distribution de plaques amyloïdes a été réalisée selon ....
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Résultats
Le protocole abrégée seule étape sarkosyl-fractionnement a été utilisé pour enrichir les agrégats de protéines insolubles dans un détergent de contrôle et de cerveau post-mortem (Figure 1). Les protéines des fractions TH-S, S1, S2 et P2 ont été résolus par SDS-PAGE, fixée pendant 15 min dans le bleu de Coomassie bleu tampon fixateur suivie d’une coloration douce avec du tampon de coloration bleu de Coomassie brillant bleu G-250. L’étape de remise en suspensio.......
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Discussion
Dans les présentes, nous introduisons et discuter d’un protocole de détergent-fractionnement seule étape abrégé qui s’applique à un large éventail d’applications expérimentales allant d’analyse basé sur la spectrométrie de masse protéomique d’une protéine fonctionnelle mauvais repliement des essais et transfert Western. 5 , 6 , 7 , 10 cette méthodologie est peut-être plus efficace lorsqu’il est.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient les Drs Jim Lah et Allan Levey, département de neurologie de Emory, des suggestions et des commentaires utiles. Ce travail a été en partie financé par le partenariat de médecine accélérant (U01AG046161-02), le Emory Alzheimer de grant Disease Research Center (P50AG025688) et un National Institute on Aging accordent (R01AG053960-01) à SNRC Cette recherche a été également soutenue en partie par le noyau de neuropathologie de l’octroi d’installations centrales de Emory Neuroscience NINDS, P30NS055077.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase, sans EDTA (100X) | Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase | Thermo Fisher | 78441 |
| Système de dismembrateur sonique (ultrasonateur) | Fisher Scientific | FB505110 ultrasoniseur à micropointes | |
| Optimax TLX Ultracentrifugeuse | Beckman Coulter | 361545 | rotor réfrigéré |
| TLA120.1 | Rotor d’ultracentrifugeuse | Beckman Coulter | 362224 |
| Tubes en polycarbonate 500 ul (8 x 34 mm), tube | Beckman Coulter | 343776 | pour rotor TLA120.1 |
| Tampon d’échantillon SDS 4X Solution d’échantillon | SDS-PAGE | TCEP faite maison | |
| , pH neutre | réducteur | Thermo Fisher | 77720 |
| Thermo | Fisher | 37542 | tampon bloquant |
| (TBS) tampon bloquant + 0,05 % Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | tampon bloquant et diluant anticorps |
| 4-12 % gels Bolt Bis-Tris Plus, 10 puits Thermo | Fisher | NW04120BOX | gels préfabriqués SDS-PAGE |
| MES Tampon de fonctionnement SDS (20X) | Thermo Fisher | B0002 | Tampon de fonctionnement SDS-PAGE |
| N-Lauroylsarcosine sel de sodium (sarkosyl) | Sigma Détergent Aldrich | L5777-50G | |
| Anticorps anti-Tau-2 (pan tau) | Anticorps Chemicon | MAB375 | |
| Anticorps anti-phospho-thréonine 231 Anticorps Tau | Millipore | MAB5450 | Anticorps |
| anti-phospho-séroïne 202 et thréonine 205 Anticorps Tau (AT8) | Anticorps Thermo Fisher | MN1020 | |
| Anticorps anti-antigène endosomique précoce 1 (EEA1) | abcam | Anticorps ab2900 | |
| Alexa Fluor 680 Anticorps secondaires IgG (H+L) anti-souris Anticorps Thermo | Fisher | A21058 | Anticorps |
| Alexa Fluor 790 anti-IgG (H+L) âne Anticorps Thermo | Fisher | A11374 | Anticorps |
| iBlot2 Système de transfert sec Thermo | Fisher | IB21001 | Gel |
| , nitrocellulose, mini | Transfert de gel Thermo Fisher | IB23002 |
Références
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991(1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L.
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Réimpressions et autorisations
