मानव गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय का संवर्धन
Summary
मानव गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन के लिए एक संक्षिप्त आंशिक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ।
Abstract
इस अध्ययन में, हम मानव गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन के लिए एक संक्षिप्त एकल कदम अंश प्रोटोकॉल का वर्णन । ईओण डिटर्जेंट N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) प्रभावी ढंग से solubilizes natively मस्तिष्क ऊतक में जोड़कर प्रोटीन की अनुमति neurodegenerative proteinopathies की एक विस्तृत श्रृंखला से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन, जैसे अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग और पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, और prion रोगों । मानव नियंत्रण और विज्ञापन गुजाइश मस्तिष्क के ऊतकों homogenized और sarkosyl की उपस्थिति में ultracentrifugation द्वारा अवसादी रोग phosphorylated ताऊ, neurofibrillary के कोर घटक सहित डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय को समृद्ध किया गया विज्ञापन में उलझ । वेस्टर्न सोख्ता ने एग्रीगेट phosphorylated-ताऊ और डिटर्जेंट-घुलनशील प्रोटीन, अर्ली Endosome प्रतिजन 1 (EEA1) के नियंत्रण और विज्ञापन मस्तिष्क में अंतर घुलनशीलता का प्रदर्शन किया । Proteomic विश्लेषण में भी β-amyloid (Aβ), ताऊ, snRNP70 (U1-70K) के संवर्धन का पता चला, और apolipoprotein ई (APOE) विज्ञापन मस्तिष्क के sarkosyl में अघुलनशील नियंत्रण के उन लोगों की तुलना में, पिछले ऊतक भिन्नीकरण रणनीतियों के अनुरूप . इस प्रकार, यह सरल संवर्धन प्रोटोकॉल पश्चिमी सोख्ता और कार्यात्मक प्रोटीन सह एकत्रीकरण परख से लेकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटियोमिक् को लेकर प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आदर्श है ।
Introduction
अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग (पीडी), हटिंगटन के रोग (एचडी), पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस), और बारीकी से संबंधित prion रोगों जैसे Neurodegenerative रोगों के क्रमिक संचय की विशेषता proteinopathies है साथ ही संज्ञानात्मक गिरावट के साथ मस्तिष्क में डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय । 1 , 2 इस साझा रोग विशेषता इन neurodegenerative रोगों के एटियलजि और pathophysiology में एक केंद्रीय भूमिका निभाने के लिए सोचा है । 2 इन समुच्चय आम तौर पर बहुलक amyloid फाइबर से मिलकर बनता है, जो दोहराया प्रोटीन का प्रदर्शन पार β-संरचना की दोहराने इकाइयों से बना रहे हैं । 1 , 2 , 3 , 4 जैव रासायनिक, amyloid समुच्चय अत्यधिक रासायनिक या थर्मल विकार और solubilization,3 जो पारंपरिक जैव रासायनिक तकनीकों के माध्यम से उनकी शुद्धि, विश्लेषण और अध्ययन करने के लिए अद्वितीय चुनौतियों प्रस्तुत करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं । 2 , 5 , ६ , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 आश्चर्य की बात है, डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन अंश neurodegenerativeed प्रोटीन के संचय से जुड़े रोगों के pathophysiology में ज्यादा शोध का ध्यान केंद्रित किया गया है । ६ , 12 , 13 , 14
जैव रासायनिक भिन्नीकरण तकनीक अक्सर गुजाइश मस्तिष्क homogenates से डिटर्जेंट-अघुलनशील अंश को समृद्ध करने के लिए उपयोग किया गया है. ६ , 12 , 13 , 14 सबसे आम तरीकों में से एक के buffers और डिटर्जेंट बढ़ाने के stringency के साथ ऊतक homogenates के अनुक्रमिक निष्कर्षण शामिल है, ultracentrifugation के लिए घुलनशील और अघुलनशील भागों विभाजन के बाद । एक सामान्य रूप से प्रयुक्त अनुक्रमिक भिन्नता प्रोटोकॉल6,14 एक डिटर्जेंट-मुक्त कम नमक में जमे हुए ऊतक के नमूनों की homogenization शामिल है (एलएस) बफर और परिणामी अघुलनशील छर्रों तो क्रमिक रूप से निकाले जाते हैं उच्च नमक युक्त बफ़र्स, गैर ईओण डिटर्जेंट, उच्च सुक्रोज, ईओण डिटर्जेंट और अंत में यूरिया की तरह chaotropes । ६ , 14 इस तरह के एक अनुक्रमिक आंशिक प्रोटोकॉल का एक स्पष्ट दोष पर्याप्त समय और श्रम उंहें पूरा करने के लिए आवश्यक प्रतिबद्धता है । homogenization और ultracentrifugation सहित, एक ठेठ पांच कदम आंशिक प्रोटोकॉल कई घंटे या दिन भी पूरा करने के लिए ले जा सकते हैं । 4 , ६ , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 इसके अतिरिक्त, के रूप में कई रोग प्रोटीन समुच्चय में अघुलनशील रहना सभी लेकिन कठोर शर्तों19,20 उत्पंन अंशों के अधिकांश सीमित मूल्य के हैं । इस प्रकार, कम-कड़े भिंन कदम उच्च नमक सांद्रता और गैर ईओण डिटर्जेंट का उपयोग मोटे तौर पर बेमानी हैं ।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ईओण डिटर्जेंट N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) एक सरलीकृत एकल कदम डिटर्जेंट आंशिक प्रोटोकॉल के लिए एक उत्कृष्ट उंमीदवार है । 5 , ६ , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 एक denaturing डिटर्जेंट के रूप में, sarkosyl के लिए काफी कड़े है solubilizinged प्रोटीन समुच्चय बीटा से बना-amyloid (Aβ),6,11 के बिना natively तह प्रोटीन मस्तिष्क में विशाल बहुमत solubilize phosphorylated ताऊ (pTau),6 टीआर डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन ४३ (टीडीपी-४३),14 अल्फा-synuclein,12,13 scrapie,23 या U1 स्मॉल न्यूक्लियर ribonucleoproteins (U1 snRNPs) जैसे U1-70K । 5 , 21 , 22 के रूप में sarkosyl सर्वव्यापी anionic डिटर्जेंट सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) की तुलना में कम कठोर है, यह oligomeric उपचार का सामना नहीं कर सकता है कि एक प्रकार का प्रोटीन समुच्चय के कम मजबूत एसडीएस रूपों को बरकरार रखता है । 9
पहले, हम एक संक्षिप्त डिटर्जेंट-अंश प्रोटोकॉल है कि अधिक श्रमसाध्य अनुक्रमिक भिंन तरीके से तुलनीय परिणाम प्राप्त वर्णित है । 5 कम कड़े भिन्नीकरण चरणों को छोड़ कर, हम गुजाइश मानव मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन के लिए एक सतही एकल कदम भिन्नीकरण प्रोटोकॉल विकसित करने में सक्षम थे. 5 इस विस्तृत प्रोटोकॉल वर्णित के साथ साथ प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है पश्चिमी सोख्ता और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटियोमिक् कार्यात्मक प्रोटीन खुलासा और एकत्रीकरण के लिए बीज परख । 5 , ६ , 21
Protocol
आचार कथन: सभी मस्तिष्क के ऊतकों से प्राप्त किए गए एमोरी अल्जाइमर & #39; एस रोग अनुसंधान केंद्र (ADRC) ब्रेन बैंक. मानव गुजाइश ऊतकों को उचित संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) प्रोटोकॉल के तहत अधिग्रहीत किया गया…
Representative Results
Discussion
इस के साथ हम परिचय और एक संक्षिप्त एकल कदम डिटर्जेंट-आंशिक प्रोटोकॉल है कि प्रयोगात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री से लेकर अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है पर चर्चा कार्यात्मक प्रोटीन के लि…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । जिम लह और एलन Levey, न्यूरोलॉजी के एमोरी विभाग, सहायक टिप्पणियां और सुझावों के लिए । यह काम आंशिक रूप से तेजी से दवा भागीदारी अनुदान (U01AG046161-02), एमोरी अल्जाइमर रोग अनुसंधान केंद्र (P50AG025688) और एजिंग अनुदान (R01AG053960-01) पर एक राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया था N.T.S. करने के लिए इस अनुसंधान भी एमोरी तंत्रिका विज्ञान NINDS कोर सुविधाएं अनुदान, P30NS055077 के Neuropathology कोर द्वारा भाग में समर्थन किया गया था ।
Materials
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| 1.5 ml polypropylene Pellet Pestle | Kimble Chase | 749521-1500 | homogenization tool |
| cordless motor for Pellet Pestle | Kimble Chase | 749540-0000 | homogenization tool |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
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