رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي مع تشيك-سيق في<em> ساكاروميسز سيريفيسياي</em
Summary
نحن تصف الكروماتين الانقسام الذاتية إلى جانب تسلسل عالية الإنتاجية (تشيك-سيق)، المناعية لونين (رقاقة) طريقة متعامدة لرسم الخرائط مواقع ملزمة البروتين الجينوم على نطاق واسع مع نوكليس نوكوكلياز (منيس) البروتينات الانصهار.
Abstract
رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي أمر بالغ الأهمية لفهم التنظيم الجيني، وإعادة عرض لونين، وغيرها من العمليات المقيمين الكروماتين. الفورمالديهايد يشابك تليها لونين مناعي وارتفاع الإنتاجية الإنتاجية (X-تشيب-سيق) وقد استخدمت لكسب العديد من الأفكار القيمة في علم الأحياء الجينوم. ومع ذلك، X-تشيب-سيق لديه قيود مرتبطة مرتبطة كروسلينكينغ وسونيكاتيون. رقاقة الأصلي تجنب هذه العيوب عن طريق حذف تشابك، ولكن غالبا ما يؤدي إلى الانتعاش الفقراء من البروتينات المرتبطة الكروماتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن جميع الطرق القائمة على رقاقة تخضع لاعتبارات الجودة الأجسام المضادة. وقد استخدمت أيضا أساليب الأنزيمية لرسم خرائط التفاعلات الحمض النووي للبروتين، والتي تنطوي على الانصهار من البروتين من الاهتمام لانزيم تعديل الحمض النووي، لتعيين التفاعلات البروتين الحمض النووي. نحن في الآونة الأخيرة مجتمعة واحدة من هذه الطريقة، لونين الانقسام الذاتية (تشيك)، مع تسلسل الإنتاجية العالية كما تشيك-سيق. تشيك-سيق يعتمد على الانصهار من الكروماتين- أسوكالبروتين إاتد من الفائدة إلى نوكلياز ميكروكوكال (منيس) لتوليد استهداف الحمض النووي الانقسام في وجود الكالسيوم في الخلايا الحية. تشيك-سيق لا يقوم على إمونوبريسيانتاتيون وبالتالي التحايل على المخاوف المحتملة مع يشابك، صوتنة، لونين سولوبيليزاتيون، وجودة الأجسام المضادة مع توفير عالية الدقة رسم الخرائط مع الحد الأدنى من إشارة الخلفية. ونحن نتصور أن تشيك-سيق سوف تكون نظير قوي ل تشيب، وتوفير وسيلة مستقلة من أجل التحقق من صحة النتائج تشيب-سيق، واكتشاف رؤى جديدة في التنظيم الجيني.
Introduction
رسم الخرائط مواقع ملزمة من عوامل النسخ (تفس)، إعادة تشكيل الكروماتين، والعوامل التنظيمية الأخرى المرتبطة بالكروماتين هو المفتاح لفهم جميع العمليات القائمة على الكروماتين. في حين استخدمت المناعية لونين وارتفاع تسلسل الإنتاجية (تشيب-سيق) نهج لكسب العديد من الأفكار الهامة في علم الأحياء الجينوم، لديهم قيود ملحوظة. لقد أدخلنا مؤخرا طريقة بديلة، يطلق عليها الانقسام الداخلي لونين والإنتاجية العالية تسلسل (تشيك-سيق) 1 ، للتحايل على هذه السلبيات.
وغالبا ما يتم تنفيذ تشيب-سيق مع خطوة الفورمالديهايد الأولي يشابك (X- رقاقة-سيق) للحفاظ على التفاعلات البروتين الحمض النووي. ومع ذلك، فقد أشار عدد من الدراسات الحديثة أن X-تشيب-سيق يلتقط التفاعلات البروتين الحمض النووي عابرة أو غير محددة 2 ، 3 ، 4 ، 5 <سوب>، 6 ، 7 ، 8 ، مما يؤدي إلى مواقع ملزمة إيجابية كاذبة. وبالإضافة إلى ذلك، سونيكاتيون، وتستخدم عادة لتفريق لونين في التجارب X- تشيب-سيق، مناطق المقصات تفضيلي من لونين مفتوح، مما يؤدي إلى الانتعاش منحازة شظايا من هذه المناطق 9 ، 10 . سونيكاتيون ينتج أيضا خليط غير متجانسة من أطوال الشظايا، مما يحد في نهاية المطاف قرار الموقع ملزمة، على الرغم من أن إضافة خطوة الهضم نوكلياز يمكن أن تحسن كثيرا القرار 11 ، 12 . طرق رقاقة المحلية مثل المناطق المحتلة من الجينوم من تقارب تنقيته لونين معزولة طبيعيا (أورغانيك) 13 لا تستخدم كروسلينكينغ وشظية لونين مع نوكلياز ميكروكوكال (منيس)، والتخفيف من التحيزات المحتملة المرتبطة التشابك الفورمالديهايد وسونيكاتيون. ومع ذلك،فإن ذوبانية العديد من البروتينات المرتبطة بالكروماتين في ظل ظروف خفيفة نسبيا المطلوبة لاستخراج الكروماتين الأصلي ضعيف، مما قد يؤدي إلى انخفاض النطاق الديناميكي و / أو السلبيات الكاذبة 14 .
في حين أن التكرارات المختلفة من تشيب سيق، هي الأكثر شيوعا لرسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات الحمض النووي للبروتين، كما تم تنفيذ عدة تقنيات رسم الخرائط على أساس انصهار البروتينات التي تهم مختلف الأنزيمات تعديل الحمض النووي. واحد من هذه النهج هو دنا أدينين ميثيل ترانسفيراس تحديد (داميد) 15 ، حيث يتم دمج البروتين ملزم من الكروماتين من الفائدة إلى وراثيا ويتم التعبير عن هذا الانصهار في الخلايا أو الحيوانات، مما أدى إلى مثيلة من تسلسل غاتس القريبة لمواقع ملزمة للبروتين. داميد مفيد في أنه لا يعتمد على مناعي وهكذا يتجنب التشابك، الأجسام المضادة، أو لونين الانحلال. كما يتم تنفيذها في الجسم الحي . ومع ذلك، يقتصر قرار داميد على مقياس الكيلوباس ونشاط الميثيلات من بروتين الدم الانصهار هو كونستيتوتيف. وهناك طريقة ثانية تقوم على الانزيم الانزيمية هي استدعاء بطاقة- 16 ، الذي يوظف الانصهار من عامل من الفائدة إلى ترانسبوزاز، توجيه التكامل موقع معين من ترانسبوسونس. مثل داميد، استدعاء بطاقة المتابعة لا يستند إلى إمونوبريسيانتاتيون وبالتالي لديها مزايا مماثلة، مع فائدة إضافية من زيادة القرار. ومع ذلك، قد تقيد بطاقة الاتصال المتابعة بالتسلسل التحيز من ينتقل ويعتمد أيضا على وجود مواقع تقييد قريبة من مواقع الإدراج ترانزوسون.
وهناك طريقة الانزيمية الثالثة الانصهار، وضعت في مختبر لامللي، هو لونين الانقسام الذاتية (تشيك) 17 . في تشيك، يتم التعبير عن الانصهار بين البروتين المرتبط بالكروماتين و منيس في الخلايا، وعلى إضافة الكالسيوم لتنشيط منيس، يتم تشريح الحمض النووي الأقرب إلى مواقع ملزمة للموسومةعامل ( الشكل 1 ). جنبا إلى جنب مع النشاف الجنوبية، وقد استخدمت تشيك لتوصيف هيكل الكروماتين والبروتين ملزمة في عدد من لوكسي الفردية في الخميرة 17 ، 18 ، وتم دمجها مع تحليل ميكروأري منخفضة الدقة للتحقيق في التفاعل من مكونات المسام النووية مع الخميرة الجينوم 19 . تشيك يقدم فوائد مماثلة ل داميد و بطاقة دعوة المتابعة، وقرارها هو تقريبا زوج واحد قاعدة عند تحليل التمديد التمهيدي 19 . تشيك هو أيضا يمكن السيطرة عليها: الانقسام الحمض النووي قوي مناس يعتمد على إضافة مليمولار الكالسيوم، وضمان أن منيس غير نشط في تركيزات منخفضة الكالسيوم الحرة لوحظ في خلايا الخميرة الحية 20 .
في السابق، افترضنا أن الجمع بين تشيك مع تسلسل الإنتاجية العالية (تشيك-سيق) من شأنه أن يوفر خرائط عالية الدقة من مواقع الربط تف. في الواقع، تشيك-sq ولدت خرائط عالية الدقة من الخميرة الناشئة العوامل التنظيمية العامة (غرفس) Abf1، Rap1، و Reb1 عبر الجينوم 1 . وقد نجحنا أيضا في تطبيق تشيك-سيق على مجمع الوسطاء المعياري، وهو عامل حفظي عالمي أساسي محفظ 21 ، وتوسيع نطاق تطبيق تشيك-سيق إلى مجمعات الحجم ميغادالتون التي لا تتصل مباشرة دنا وقد يكون من الصعب رسم بواسطة رقاقة- . تشيك-سيق هو وسيلة قوية على حد سواء للتحقق من صحة مستقلة النتائج تشيب-سيق وتوليد رؤى جديدة في تنظيم العمليات المقيمين الكروماتين. هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ هذه الطريقة في مهدها الخميرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد أظهرنا أن تشيك يمكن تعيين فئات متنوعة من البروتينات الخميرة على الكروماتين، وتوقع أنه سيتم تطبيقها على نطاق واسع على عائلات مختلفة من صناديق الاستئناف وغيرها من العوامل ملزم الكروماتين في الخميرة. تشيك-سيق هو مفيد في أنه لا يتطلب كروسلينكينغ، لونين سولوبيليزات?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مصطفى صالح وجاي توريغني على قراءة نقدية للمخطوطة وستيفن هان وستيفن هينيكوف للحصول على الإرشاد والدعم خلال تطوير تشيك-سيق وتطبيقه على مجمع الوسيط. ويدعم سغ من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM053451 و R01GM075114 و جيز هو معتمد من قبل صناديق بدء تشغيل جامعة إنديانا.
Materials
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive ‘Phantom Peaks’ in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it’s good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
