Cytométrie de flux d'imagerie microfluidique par détection asymétrique Microscopie optique à temps-étirement (ATOM)

Summary

Ce protocole décrit la mise en place d'un système de microscopie optique à étirage temporel de détection asymétrique pour l'imagerie monocellulaire dans un flux microfluidique ultra-rapide et ses applications dans la cytométrie de flux d'imagerie.

Abstract

La mise à l'échelle du nombre de paramètres mesurables, qui permet une analyse de données multidimensionnelle et donc des résultats statistiques de plus haute confiance, a été la tendance principale dans le développement avancé de la cytométrie en flux. En particulier, l'ajout de capacités d'imagerie haute résolution permet l'analyse morphologique complexe des structures cellulaires / sous-cellulaires. Ceci n'est pas possible avec les cytomètres de flux standard. Cependant, il est précieux de faire progresser notre connaissance des fonctions cellulaires et peut bénéficier de la recherche en sciences de la vie, du diagnostic clinique et de la surveillance de l'environnement. L'intégration des capacités d'imagerie dans la cytométrie de flux compromet le débit d'analyse, principalement en raison des limitations de la vitesse et de la sensibilité dans les technologies de caméra. Pour surmonter cette vitesse ou le défi de débit face à la cytométrie de flux d'imagerie tout en préservant la qualité de l'image, on a démontré que la microscopie optique étirable à distance (ATOM) de détection asymétrique permettait une imagerie monocellulaire à contraste élevéAvec une résolution sous-cellulaire, à un débit d'image aussi élevé que 100 000 cellules / s. Basé sur le concept d'imagerie conventionnelle à l'étirement du temps, qui repose sur l'encodage et la récupération d'images tout-optique grâce à l'utilisation d'impulsions laser à large bande ultra-rapide, ATOM avance les performances d'imagerie en améliorant le contraste d'image des cellules non marquées / non colorées. Ceci est obtenu en accédant à l'information de gradient de phase des cellules, qui est codée spectralement en impulsions à large bande à un seul coup. Par conséquent, ATOM est particulièrement avantageux dans les mesures à haut débit de la morphologie et de la texture d'une seule cellule, ce qui indique des types de cellules, des états et même des fonctions. En fin de compte, cela pourrait devenir une puissante plate-forme de cytométrie de flux d'imagerie pour le phénotypage biophysique des cellules, en complément de l'analyse cellulaire à base de marqueurs biochimiques à l'état actuel de l'art. Ce travail décrit un protocole pour établir les modules clés d'un système ATOM (du frontend optique vers les données pBackend de traitement et de visualisation), ainsi que le flux de travail de la cytométrie de flux d'imagerie à base d'ATOM, en utilisant des exemples de cellules humaines et de micro-algues.

Introduction

L'imagerie optique présente un outil puissant et un test basé sur des cellules pour visualiser (presque) de façon non invasive la répartition spatiale détaillée de plusieurs composants cellulaires / subcellulaires, dévoilant ainsi une multitude de signatures morphologiques, biophysiques et biomoléculaires des cellules. Cependant, cette capacité à extraire des informations à haute teneur provenant de cellules isolées a généralement été compromise lorsqu'une population de cellules énorme et hétérogène devait faire l'objet d'une enquête. Cela marque un compromis commun entre les tests basés sur des cellules entre le débit de mesure et le contenu. Un exemple notable est que l'ajout de capacité d'imagerie à la cytométrie de flux a entraîné une réduction du débit d'au moins 1 à 2 ordres de grandeur par rapport à celle des cytomètres classiques de flux de non-imagerie. Bien qu'il puisse offrir une analyse morphologique simple à une cellule qui n'est pas possible avec les cytomètres de flux standard ¹ , la cytométrie de flux d'imagerie n'a généralement pas de débit suffisant pour l'identificationD'enrichir l'hétérogénéité cellulaire avec une forte confiance statistique. Ceci est nécessaire pour de nouvelles découvertes en biologie et pour une compréhension de la pathogenèse des maladies. Le défi technique principal réside dans la limite de vitesse inhérente imposée par les stratégies d'image optique communes: la numérisation du faisceau laser ( par exemple, par des miroirs galvanométriques) et / ou des capteurs d'image ( par exemple, un dispositif à couplage de charge (CCD) Oxyde semi-conducteur (CMOS)). La vitesse de balayage laser est intrinsèquement limitée par l'inertie mécanique des miroirs de balayage, tandis que la cadence d'image de CCD ou de CMOS est limitée par le compromis fondamental entre la vitesse d'imagerie et la sensibilité ( c.-à-d. , et vice versa).

Basé sur un mécanisme de codage d'image tout-optique et ultra-rapide, l'imagerie optique à l'étirement du temps a été démontrée comme une plate-forme attrayante pour le cytrate de flux d'imagerie à haut débitOmeters, sans besoin des capteurs d'images classiques ou du balayage laser mécanique ^{2 , 3} . Des descriptions détaillées du principe de fonctionnement de l'imagerie étirable peuvent être trouvées dans les références ^{4 , 5 , 6 , 7} . En bref, il consiste en deux étapes de mappage interchangeables: (i) codage spectral (mappage de l'espace de longueur d'onde), dans lequel les coordonnées spatiales de l'échantillon imagé sont mappées à différentes longueurs d'onde sur le spectre du faisceau lumineux ^{8 , 9} , Et (ii) une transformation de Fourier dispersive (mappage de longueur d'onde) ⁹ , dans laquelle les composantes de longueur d'onde des impulsions laser individuelles sont transformées (étirées) par dispersion de vitesse de groupe (GVD) en formes d'ondes temporelles (longueur d'onde) ( Figure 1 ). Un importantLa fonctionnalité de l'imagerie étirable est l'amplification optique, qui joue un rôle essentiel dans la lutte contre la perte de sensibilité due à la photodétection ultra-rapide et à la perte de GVD, améliorant ainsi le rapport signal / bruit d'image (SNR) sans être contaminé par le bruit photodétecteur ⁹ . Étant donné que chaque impulsion laser code pour un balayage en ligne de l'échantillon imagé, qui est orthogonal au flux unidirectionnel des cellules, un taux de balayage de ligne efficace est déterminé par le taux de répétition laser, qui est généralement au-delà de 10 MHz. Cette opération ultra-rapide permet une capture d'image à une seule cellule sans flou, à un débit de 10 000 à 100 000 cellules / s ( c.-à-d. 10 à 100 fois plus élevé que la cytométrie de flux d'imagerie conventionnelle). En conséquence, l'imagerie temporelle pourrait trouver des applications uniques dans le dépistage à base d'images à une seule cellule à haut débit, surtout lorsqu'il est nécessaire d'identifier une hétérogénéité inconnue ou des cellules aberrantes / aberrantes dans une population importante (des milliers à des millions de Cel Ls), comme le dépistage de cellules cancéreuses rarement ¹⁰ ou la classification des microalgues ¹¹ .

L'imagerie étirable repose principalement sur la capture d'image de champ lumineux (BF), à partir de laquelle le contraste de l'image est généré par diffusion de lumière et absorption à partir des cellules ^{2 , 3 , 9 , 10 , 11} . De telles capacités d'imagerie à une seule cellule exemptes d'étiquettes pourraient contourner les effets néfastes associés aux étiquettes fluorescentes, telles que la cytotoxicité et la photoblanchiment, et fournissent pourtant des informations précieuses pour une analyse monocellulaire basée sur la texture et la morphologie cellulaire et sous-cellulaire. Ces paramètres exempts d'étiquettes se sont révélés efficaces pour la classification des images en profondeur, en particulier lorsqu'une population cellulaire énorme est disponible ^{11 ,}"Xref"> 12. Cependant, à plusieurs reprises, l'imagerie BF ne fournit pas un contraste suffisant pour révéler la morphologie détaillée des cellules transparentes exemptes d'étiquettes. Différentes modalités d'imagerie sans étiquetage, de contraste de phase et d'étirement du temps ont été développées pour améliorer le contraste de l'imagerie aux cadences d'images ultra-fines ^{13 , 14 , 15} . Parmi ces techniques, on a développé une microscopie optique (ATOM) à distance de détection asymétrique pour révéler le contraste de gradient de phase (différentiel-interférence-contraste-DIC) basé sur un concept similaire à la photographie de Schlieren, Imagerie libre et à contraste élevé de cellules individuelles à une vitesse microfluidique ultra-haute (jusqu'à 10 m / s) ¹⁶ . Cet effet peut être facilement généré par détection ou illumination oblique en bloquant partiellement le chemin du faisceau codé par image ou en inclinant le faisceau avant la photodétection. Un autre avantage d'ATOM est sonAfin d'acquérir simultanément deux contrastes de gradient de phase selon des orientations opposées. La soustraction d'intensité et la sommation de deux images de contraste opposé produisent respectivement le contraste de gradient de phase différentiel et le contraste d'absorption à partir du même balayage de ligne. Ce travail présente un protocole détaillé décrivant la mise en œuvre de l'ATOM, y compris la mise en place de la configuration optique, la préparation des échantillons et l'acquisition et la visualisation des données. Plus précisément, ce travail démontre l'opération ATOM avec l'imagerie monocellulaire des cellules sanguines humaines, des cellules cancéreuses et du phytoplancton (microalgues). Cela met en évidence l'applicabilité d'ATOM à la cytométrie de flux d'imagerie, non seulement dans l'arène biomédicale, mais aussi dans la recherche marine et biocarburants ^{17 , 18} .

Protocol

1. Préparation de l'échantillon Préparation de l'échantillon (cellules adhérentes, cellules MCF-7) Retirez le plat de culture cellulaire de l'incubateur et égouttez le milieu de culture. Rincer les cellules sur un plat avec 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer le milieu de culture excessif. Ajouter 3 mL d'une solution de trypsine à 0,25% dans le plat de culture (diamètre de 100 mm) et mettre dans un incubateur à …

Representative Results

Ce travail illustre deux démonstrations d'imagerie mono-cellulaire par ATOM: une avec des cellules de mammifères (cellules mononucléaires de sang périphérique humain (PBMC) et cellules de cancer du sein (MCF-7)) et une autre avec phytoplancton (Scenedesmus et Chlamydomonas). La première expérience a été motivée par l'intérêt croissant pour la biopsie liquide pour la détection, l'énumération et la caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) d…

Discussion

Il existe plusieurs détails techniques qui nécessitent une attention particulière pendant la configuration du système ATOM. Tout d'abord, il est essentiel de noter que l'éclairage asymétrique / oblique encodé par spectralité pourrait introduire des composantes résiduelles de gradient de phase ( c'est-à-dire l'effet d'ombrage) dans le contraste d'absorption et influencer l'amélioration du contraste de gradient de phase dans ATOM. Par conséquent, cet effet d'illuminatio…

Materials

Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X	Nikon	MRF07420	Objective lens (Obj2)
Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X	Olympus	RMS40X-PF	Objective lens (Obj1)
N-BK7 Plano-Convex Lenses	Thorlabs	LA1145-C	For relaying spectral shower
FC/APC Fiber Collimation Package	Thorlabs	F220APC-1064	For outputing and collecting laser pulses
Pellicle beamsplitter	Thorlabs	BP145B3	For making beam replica
Protected silver mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	For reflecting light
800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver	Newport	1544-B	For converting light into electrical signal
Infiniium High-Performance Oscilloscope	Agilent	DSOX91604A	To save the light-converted electrical signals
HI1060 optical fiber	Corning	HI1060	Optical fiber for time-stretch
YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER	Keopsys	KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA	Optical in-line amplifier
Holographic grating	Wasatch Photonics	020305-6	Grating
Infuse/Withdraw Syringe Pumps	Harvard Apparatus	PHD 2000	Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels