Une méthode d’isolement roman de Grade clinique pour les cellules stromales de rein humain périvasculaires

Summary

Nous présentons ici une méthode d’isolation et de la culture de roman de grade clinique pour rein périvasculaires des cellules stromales (kPSCs) basé sur la perfusion des organes entiers avec des enzymes digestives et enrichissement NG2-cellule. Avec cette méthode, il est possible d’acquérir le nombre de cellules suffisant pour la thérapie cellulaire.

Abstract

Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont homéostatiques et immunitaire modulateurs cellules des tissus qui ont montré des effets bénéfiques dans les maladies des reins et de la transplantation. Cellules stromales périvasculaires (PSC) partagent des caractéristiques avec la moelle osseuse MSCs (bmMSCs). Cependant, ils possèdent également, probablement en raison de l’empreinte locale, les propriétés spécifiques des tissus et jouent un rôle dans l’homéostasie tissulaire locale. Cette spécificité tissulaire peut entraîner réparation spécifique des tissus, également dans le rein humain. Nous avons montré précédemment que rein humain PSC (kPSCs) ont amélioré rénales épithéliales de cicatrisation tandis que bmMSCs n’avait pas ce potentiel. De plus, kPSCs peut améliorer de lésion rénale in vivo. Par conséquent, les kPSCs constituent une source intéressante pour la thérapie cellulaire, en particulier pour les maladies des reins et de la transplantation rénale. Ici, nous montrons aux méthodes d’isolement et de la culture pour kPSCs de transplantation-grade des reins humains basés sur la perfusion ensemble-orgue d’enzymes digestives via l’artère rénale et un enrichissement pour le marqueur périvasculaires NG2. De cette façon, les quantités de grandes cellules peuvent être obtenues qui conviennent à la thérapie cellulaire.

Introduction

Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules modulateurs immunitaires qui ont été initialement isolées de la moelle osseuse. Ils sont caractérisés par leur morphologie, capacité à se différencier en gras, des os et du cartilage et adhérence plastique fusiforme. MSCs expriment les marqueurs stromales CD73, CD90, CD105 tout en étant négatif pour les marqueurs CD31 et CD45^1,2,3. MSCs sont un candidat prometteur pour la thérapie cellulaire en raison de leurs tissus homéostatique et immunomodulatrices. bmMSCs sont actuellement à l’étude dans des essais cliniques pour plusieurs maladies, dont les maladies des reins et une transplantation rénale comme revu ailleurs⁴.

Antérieurement, il a été montré que périvasculaires des cellules de plusieurs différents organes solides, y compris le tissu adipeux, placenta et le muscle squelettique partagent des caractéristiques avec MSCs⁹. Cependant, ces cellules présentent également des fonctions spécifiques des tissus qui peuvent se traduire par organotypique réparation¹⁰. Les cellules humaines périvasculaires myocardique, par exemple, stimulent angiogénique réponses après l’hypoxie et se différencient en cardiomyocytes, tandis que les cellules périvasculaires isolées des autres tissus n’ont pas montré de ces potentiels¹¹.

Cellules stromales périvasculaires peuvent également être isolées des souris^12,,du¹³,¹⁴ et^15,de rein humain¹⁶. Abondamment, nous avons caractérisé kPSCs et par rapport aux bmMSCs. Nous avons constaté que kPSCs, similaires à bmMSCs, ont des capacités immunosuppresseurs peut prendre en charge la formation du plexus vasculaire. Cependant, il sont a des tissus des différences spécifiques entre les types de cellules, comme kPSCs a montré une signature d’expression transcriptionnelle organotypique, y compris les facteurs de transcription néphrogénique HoxD10 et HoxD11. kPSCs, contrairement à bmMSCs, n’a pas subi de transformation des myofibroblastes après stimulation par TGF-β et ont été incapables de se différencier en adipocytes. En outre, kPSCs accéléré intégrité épithéliale dans un essai gratter plaie épithéliales tubulaires du rein, un phénomène qui n’a été observé avec bmMSCs. Cette plaie renforcée réparation a été véhiculée par le communiqué de facteur de croissance des hépatocytes. En outre, kPSCs amélioré des lésions rénales dans un modèle murin d’insuffisance rénale aiguë lésion¹⁵. Par conséquent, les kPSCs semblent avoir des capacités de réparation rénale supérieure et sont une source intéressante de nouveau pour la thérapie cellulaire dans les maladies des reins.

Pour pouvoir utiliser kPSCs à des fins de thérapie cellulaire, kPSCs devraient être isolés d’une manière de grade clinique avec les enzymes de grade clinique et protocoles. En outre, pour être en mesure de traiter plusieurs patients avec kPSCs du 1 donneur, nombre de cellules suffisant devrait être obtenu. Nous montrons ici en détail, la technique d’isolation de grade clinique de kPSCs de reins de toute transplantation de grade, ce qui donne un nombre suffisant de cellules à utiliser pour la thérapie cellulaire clinique.

Protocol

The local medical ethical committee and ethical advisory board of the European consortium (STELLAR) approved the research and collection of human transplant grade kidneys discarded mainly for surgical reasons. Research consent was given for all kidneys. 1. Preparations for Cell Culture Prepare a pool of platelet lysates. Store the platelets that have expired for less than 2 d in -80 °C until use (for a maximum of 1 year). NOTE: The platelets were originally sourced from a commercial vendor. Hospital surplus material distributed by the local blood bank were obtained. Thaw the platelets of at least 5 donors (preferably 10) O/N at 4 °C. Pool the platelets in a large sterile bottle, transfer to conical centrifuge tubes and spin down for 10 min at 1,960 x g at 4 °C. NOTE: The volume of platelets depends on the number of donors and the amount of hospital surplus material per donor. Pipette the supernatant to blood bags (50 mL/bag) through the barrel of a 50 mL syringe. Store at -80 °C. Preparation of cell culture medium. Defrost one bag of platelet lysates in a water bath at 37 °C. Add 1 L (i.e. 2 bottles) of Minimum Essential Medium – alpha modification (alphaMEM), 5 mL 200 mM glutamine, and 20 mL of penicillin (5,000 U/mL)/streptomycin (5,000 µg/mL) (pen/strep) to the bag. Incubate for 3 h at 37 °C. Shake the bag for degelling by gently tapping on the bag when the bag is resting on a flat surface. Filter the 5% platelet lysates medium by pulling the lysates through the filter of the transfusion system with a sterile 50 mL syringe. Aliquot the medium in 50 mL tubes and store in -80 °C until use. NOTE: Every new batch of platelet lysates is tested in cell culture and compared to the previous batch by growing cells of interest (bmMSCs or kPSCs) to confluency in both batches. In cell numbers and viability, the kPSCs or bmMCs grown in the new batch should not differ more than 10%, and the marker expression of CD73, CD90, CD105 and CD31, CD34 and CD45 as analyzed by flow cytometry should not differ. The methods of cell culture are described in section 6 of the protocol (Culture of kPSC). 2. Preparations for Cell Harvest Preparation of solutions. Prepare the plain medium by adding 10 mL of pen/strep to 500 mL (1 bottle) of Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12. Prepare the washing medium by adding 50 mL of Normal Human Serum (NHS) and 10 mL of pen/strep to 1 bottle of DMEM-F12. Prepare the enzyme-stock buffer by adding 2.9 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.2 mL NaHCO3 2.5% [w/v] and 160 µL CaCl2 (1 M) to 160 mL University of Wisconsin solution. Prepare the collagenase solution by slowly adding 20 mL of enzyme stock buffer to the bottle of GMP-grade collagenase containing >2,000 U/bottle collagenase. Dissolve at 4 °C for approximately 40 min. Gently shake several times during the dissolving period. Prepare the freeze medium by adding 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) to 45 mL NHS. Preparation of perfusion tray (Figure 1A). Clean the flow cabin and cover with surgical drapes. Heat a water bath to approximately 40 – 45 °C to heat the perfusion tray to 37 °C. Put on surgical gowns and surgical gloves. Connect a sterilized perfusion tray to the water bath to preheat the perfusion tray with warm water. Make sure that there is no air in the perfusion tray by starting with the perfusion tray in the vertical position. If necessary add more water to the water bath to prevent air infusion into the perfusion tray. Place the LS25 tube in the pump. Leave both sterile ends of the tube in the flow cabinet. Place a Kocher's forceps on one end of the tube and allow to rest on the bottom of the perfusion tray. Place a sterile gauze on top of the tube to prevent obstruction. Attach a Luer connector on the other tube end. Add approximately 100 mL of plain medium into the perfusion tray and start flushing the tube on a pump speed of 100 mL/min. 3. Kidney Cell Isolation Preparation of the kidney. Remove the kidney from the double sterile bags and place on the sterile perfusion tray (Figure 1B). Remove the perirenal adipose tissue and kidney capsule with scissors and gentle tearing (Figure 1C) and identify the renal artery on the aortic patch as shown in Figure 1D. Cannulate the renal artery with the accessory spike, fix with a sterilized tie-rip, and attach to the pump tube end with the Luer connector while the pump is on. If the tubes are not completely filled, first add more medium to the tray and flush tubes by starting the pump (Figure 1E – F). Flush the kidney with plain medium via the pump with a flow of 100 mL/min. Collagenase treatment and kidney cell isolation. Add collagenase (20 mL, >2,000 U) and DNase (2.5 mL, 1 mg/mL) to the perfusion tray (Figure 1G). Turn the kidney from time to time gently by hand. Wait until the kidney becomes soft and the perfusion liquid becomes less transparent (approximately 30 – 40 min). Gently massage the kidney (Figure 1H) until a cell suspension is obtained (Figure 1I). Remove non-digested material and the spike in the renal artery. Washing and collection of kidney cells. Add 50 mL of the NHS to the cell suspension. Drain the cell suspension from the perfusion tray by putting the pump at low flow and placing the tube first connected to the kidney above the 50 mL tubes (Figure 1J). Centrifuge at 300 x g for 7 min at 4 ˚C and remove the supernatant. Wash the pellets with washing medium containing 10% NHS and again centrifuge at 300 x g for 7 min. Repeat washing once more. Measure the volume of the cell pellets and add an equal volume of cell culture medium. Either cryopreserve the cells from here by adding freezing medium 1:1 to the cell suspension and store in cryogenic vials according to standard protocols, or continue to culture the cells (section 4). NOTE: The cell suspension contains cell clumps and requires extra steps to obtain single cells, which results in an increase in cell death. Therefore, the cells are kept in suspension and are not counted at this stage. 4. Cell Culture of Crude Kidney Cells Add approximately 1 mL of the cell suspension to 24 mL of alphaMEM 5% platelet lysates (cell culture medium) in a T175 cell culture flask (Figure 1K) and culture at 37 °C, 5% CO2. Remove the medium and cell debris after 2 d from the adherent cells and refresh the medium with 25 mL of cell culture medium. Refresh the culture medium twice a week by removing half of the medium (12.5 mL) and adding fresh medium (12.5 mL) using aseptic techniques. Culture until confluent (usually 5 – 7 d) (Figure 1L). Remove the medium, wash twice with PBS and trypsinize the cells by adding 5 mL trypsin to each T175 flask for 5 min at 37 °C. Wash in culture medium and centrifuge at 490 x g for 5 min and remove the supernatant. 5. Cell Enrichment for NG2 by Magnetic Cell Separation (Figure 1M) Prepare the cell separation buffer according to manufacturer's protocol. Resuspend the trypsinized kPSCs in 10 mL cell separation buffer. Centrifuge at 490 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the cells in 300 µL cell separation buffer. Add 100 µL FcR blocking reagen/5 x 107 cells, add 100 µL anti-melanoma (NG2) beads per 5 x 107 cells, and incubate for 30 min at 4 °C. Separate the NG2-positive fraction according to manufacturer's protocol. Add 10 mL of medium and centrifuge cells for 5 min at 490 x g. Count the cells using a Bürker counting chamber according to manufacturer's protocol. Seed the cells in a culture flask (approximately 4 x 103 cells/cm2) and incubate. NOTE: Seed the cells in the following concentrations: <250,000 in a T25 flask, 250,000 – 500,000 in a T75 flask, and 700,000 – 800,000 in a T175 flask. After magnetic cell enrichment, a positive fraction of approximately 1 – 2% is isolated. However, as this step is cell enrichment and not cell sorting, other cell types will be present in the culture (Figure 1N). After several passages (usually around 4 – 5), only a homogenous kPSC-population is present (Figure 1P). 6. Culture of kPSCs Refresh the medium twice a week by removing half of the medium and replace it with freshly thawed culture medium (Figure 1N). NOTE: The kPSCs tend to be more viable and proliferative when only half of the medium is refreshed. Passaging of kPSCs. NOTE: Passage the kPSCs at either 90 – 100% confluency, or when 3D structures appear (see Figure 1O), or when there hasn't been cell growth for more than a week. The latter two particularly might occur at early passages after cell enrichment. In this case, after passaging, the cells will usually start to grow again in monolayer culture (Figure 1P). Remove the medium from the 90 – 100% confluent cells (keep the medium for later use). Wash the flask twice with PBS (1 mL in T25, 5 mL in T75, 10 mL in T175). Add trypsin (0.5 mL in T25, 2 mL in T75, 5 mL in T175) and incubate for 5 min at 37 °C. Add the old medium to the flask and resuspend gently. Transfer to a 15 or 50 mL tube (depending on the volume) and centrifuge at 490 x g for 5 min. Count the viable cells and plate <250,000 in a T25, 250,000 – 500,000 in a T75, or 700,000 – 800,000 in a T175 (approximately 4 x 103 cells/cm2). Test the kPSCs at passage 5 or 6 (e.g., scratch assay, section 7). NOTE: Characterize the propagated cells by flow cytometry using standard protocols. Marker expression of NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC should all be positive and CD31, CD34, CD45 and HLA-DR should be negative. Test for mycoplasma, bacteria and fungi in the culture medium according to standard protocols of the clinical microbiology lab. Test the kPSCs functionally in a kidney epithelial wound scratch assay. Experiments are usually performed with sterile, flow cytometry-confirmed homogeneous kPSC populations with wound healing capacity between passage 6-8. Cryopreserve the kPSCs by adding 0.5 mL cryopreservation medium to 0.5 mL cell suspension (2 million cells per mL of culture medium) using standard protocols. NOTE: After thawing, seed the kPSCs at a higher density (106 cells in a T175). 7. Functional Test of kPSCs: Kidney Epithelial Wound Scratch Assay Culture the kPSCs in a 6-well plate at a density of 200,000 cells/well in 2 mL culture medium. After 48 h of culture at 37 °C, 5% CO2, collect the supernatant. This is the conditioned medium. Seed the HK-2 (proximal tubular epithelial cells)17 in 2 mL of Proximal Tubular Epithelial Cell (PTEC) medium consisting of a 1:1 ratio of DMEM-F12 supplemented with insulin (5 mg/mL), transferrin (5 mg/mL), selenium (5 ng/mL), hydrocortisone (36 ng/mL), triiodothyrinine (40 pg/mL), epidermal growth factor (10 ng/mL) and pen/strep, in a density of 500,000 cells per well in a 6-well cell culture plate. Culture for 48 h at 37 °C, 5% CO2. Remove the cell culture medium of the HK-2s and create a scratch wound in the monolayer of HK-2s by making a scratch with the tip of a yellow pipette point from the top to the bottom of the well. Wash the HK-2s with PBS and add the conditioned medium of the kPSCs or control medium. Mark on the bottom of the plate the area to be imaged. NOTE: The HK-2s should be confluent. Image two areas per well. Image the scratch at 4, 8, 12 and 24 h at the same marked position with an inverted bright-field microscope. Measure the scratch area in Image J using the polygon selection tool to determine the percentage of closure.

Representative Results

La méthode d’isolement de grade clinique kPSCs est résumée dans la Figure 1. Les cellules rénales brut sont isolés des reins de grade de la transplantation humaine par perfusion de collagénase. La suspension de cellules qui en résulte est cultivée jusqu’au confluent dans les lysats de plaquettes de 5 %. Ensuite la fraction de cellules stromales périvasculaires est isolée en fonction sur expression NG2. kPSCs sont des cellules adhérentes en plastique en forme de fuseau (Figure 2A) et sont positifs pour les marqueurs stromales marqueurs CD73, CD90, CD105 et périvasculaires NG2, PDGFR-B et CD146, tandis que des résultats négatifs pour le CD31, CD34, CD45 et HLA-DR (Figure 2B). En règle générale, une population homogène de kPSCs peut être rejoint au passage 4, et le kPSCs atteindre sénescence autour du passage 9-10 (Figure 2C). Nous conseillons donc d’effectuer des expériences entre passage 5-8. Pour évaluer la capacité fonctionnelle de le kPSCs isolés, nous effectuons un essai in vitro rénales épithéliales plaie gratter avec sur chaque nouveau lot de kPSCs, comme nous l’avons montré précédemment que le milieu conditionné de kPSCs peut accélérer la cicatrisation épithéliale dans ce dosage zéro15. Le milieu conditionné de kPSC fait en cultivant kPSCs pendant 48 h dans les lysats de plaquettes alphaMEM 5 % et en recueillant le liquide surnageant. Ensuite, le rein humain immortalisées tubule proximal des cellules épithéliales (HK-2)17 sont cultivées jusqu’au confluent et puis faite une plaie de grattage. Alors soit le milieu conditionné de milieu kPSCs ou le contrôle est ajouté aux puits et la vitesse de cicatrisation est mesurée. Lors de l’ajout du milieu conditionné de kPSCs, la plaie referme beaucoup plus rapide (Figure 2D). Figure 1 : Clinique Grade Isolation méthode of Human kPSCs. Transplantation de reins de grade sont canulés et perfusés avec la collagénase par l’intermédiaire de l’artère rénale (A – G) et la suspension de cellules qui en résulte est lavée et soit cryopréservés ou mis en culture (H – K). Lorsque les cellules atteignent la confluence (L), NG2 enrichissement cellulaire est exécutée (M). Les cellules sont trypsinisées quand ils sont confluentes, ont cessé de proliférer ou lorsque ces structures 3D apparaissent (N – P). Les critères de publication pour kPSCs sont la stérilité, expression du marqueur et la capacité d’améliorer la cicatrisation épithéliale tubulaire (Q). Flèche : artère rénale. Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2: Characterization of Human kPSCs. Un) kPSCs sont des cellules adhérentes en plastique, en forme de fuseau. KPSCs B) sont positifs pour les marqueurs mésenchymateux CD73, CD90, CD105, marqueurs périvasculaires NG2, PDGFR-β et CD146, tandis que des résultats négatifs pour le CD31, CD34 et CD45. kPSCs express MHC classe I (HLA-ABC) mais pas de classe II (HLA-DR). C) caractéristiques de la croissance des trois donneurs de kPSC différentes de cytométrie confirment homogène NG2 populations positives (au passage 4). kPSCs rejoindre la sénescence autour du passage 9-10. KPSCs D) sont en mesure d’améliorer la réparation épithéliales rénales dans un dosage zéro blessure. Les images représentant des moyens de contrôle et milieu de kPSC conditionné à t = 0, 4, 8 et 12 h sont indiqués. Echelle a) = 200 µm, d) = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les cellules périvasculaires ont été isolées de nombreux différents organes solides humaines, y compris le pancréas, la graisse, du cartilage et le rein de^15,9,16. La plupart des méthodes, cependant, sont basés sur de petits échantillons de tissu, qui sont disséqués et ensuite traités avec des enzymes digestives. En outre, c’est généralement pas réalisée avec des produits de qualité clinique. Cela rend ces stratégies moins approprié pour une traduction clinique directe où de grandes quantités de cellules cliniques de qualité sont nécessaires.

Nous montrons ici une méthode d’isolement roman de kPSCs humain pour des organes entiers, basé sur la perfusion avec les enzymes de grade clinique et matériaux. Le protocole est adapté à partir du protocole d’isolement clinique îlots de Langerhans en cours d’utilisation pour des applications cliniques dans notre centre¹⁸.

C’est la première méthode de grade clinique où de grandes quantités de kPSCs est possible. La variabilité du rendement de la cellule est dans une large mesure les donateurs dépendant. Toutefois, lorsque le rendement cellulaire que nous obtenons actuellement d’une fraction de la suspension cellulaire brut de trois différents donateurs est extrapolé, en théorie, un rendement moyen de 2,7 x 10¹² kPSCs par donneur pourrait être atteint. Comme MSC thérapie consiste généralement en 2 perfusions de cellule avec 1-2 x 10⁶ cellules/kg corps poids⁴, nombre de ces cellules est suffisant pour un traitement allogénique de plusieurs patients.

Une étape cruciale dans la procédure d’isolement est la durée de la digestion de collagénase. Lorsque la période de digestion est trop courte, grosses touffes de tissu restera, qui sera plus difficile à la culture. Lorsque la période de perfusion est trop longue, la mort cellulaire accrue peut-être être observée. Par conséquent, dès que le rein commence à devenir mou et des fluides moins transparents, le rein doit se faire masser doucement et la collagénase de traitement doit être arrêtée.

Une autre étape critique est la culture des cellules après enrichissement cellulaire NG2. Parfois après l’enrichissement de cellule NG2, les cellules périvasculaires ne commencent pas à proliférer ou commencent à se développer dans les structures 3D. Dans ce cas, lorsque les cellules sont trypsinisées et redéfinies, les cellules habituellement commencera à croître en culture monocouche.

Comme matériau de départ, reins de grade de la transplantation humaine rejetés principalement pour des raisons chirurgicales ont été utilisés. Voici les organes fonctionnels sans fibrose importante. Nous reconnaissons que cela pourrait être une limitation, car c’est une maladie relativement rare et difficile à obtenir la source de l’orgue. Reins explantés pourraient constituer une autre source ; Toutefois, selon le motif de l’explantation rein, ces reins peuvent contenir plus de fibrose et donc myofibroblastes, et c’est pourquoi il faut veiller car les myofibroblastes peuvent être isolées et cultivées au lieu de cellules périvasculaires.

Comme le kPSCs isolés avec ce spectacle de protocole propriétés organo-typic avec rein épithélial enroulait guérison capacités¹⁵, thérapie cellulaire avec kPSCs dans les maladies des reins et transplantation serait une intéressante application future. À cette fin, il y a plusieurs stratégies de livraison du produit cellule/cellule. La première stratégie est perfusion IV de kPSCs, tel qu’il est actuellement utilisé dans les études cliniques de bmMSC. Une autre application intéressante est l’utilisation des kPSCs ou des facteurs de kPSC-excrétés dans la perfusion de la machine avant la transplantation. De cette façon, la qualité du rein explanté pourrait améliorer qui pourrait conduire à la fonction rénale améliorée après la transplantation. Pour les deux stratégies, kPSCs sont une source intéressante de cellules nouvelles à explorer davantage à des fins cliniques.

Materials

Baxter bags	Fenwal	R4R-7004
Human platelets	Sanquin		hospital surplus material expired for less than 2 days is used
platelet lysate			custom made
Disposable sterile bottles	Corning	09-761-11
500ml PP centrifuge tubes	Corning	431123
a-MEM medium	Lonza	BE12-169F
glutamax	thermo fisher	35050038
pen/strep	Invitrogen	15070063
transfusion system	Codan	455609
DMEM-F12	life technologies	11320-074
normal human serum	Sanquin
Hepes 1M	Lonza	BE-17-737E
NaHCO3 7.5%	Lonza	BE17-613E
CaCl2 1M	Sigma-Aldrich	10043-52-4
UW	Bridge to life	32911
Heparin	Leo Pharma
collagenase NB1 GMP grade	SERVA	17455.03
DMSO	Sigma Aldrich	D2650-100ml
surgical drapes	3M Nederland	DH999969404
perfusion pump	metrohm	x007528300
pump head	metrohm	x077202600
perfusion tray			custom made
LS25 masterflex tubes	Masterflex	HV-96410-25
accessory spike	Gambro DASCO	6038020
pulmozyme	Roche
culture flasks 25 cm2	greiner	690175
culture flask 75 cm2	greiner	658170
culture flask 175 cm2	greiner	661160
Trypsin	sigma	t4174
BSA	Sigma	A2153
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500g
FcR blocking reagent	miltenyi	130-059-901
anti melanoma beads (NG2)	miltenyi	130-090-452
cellstrainer 70 µm	Corning	352350
LS columns	Miltenyi	130-042-401
MACS magnet	miltenyi	130-090-976
CD34 FITC	BD	555821
CD45 APC	BD	555485
CD146 PE	BD	550315
NG2 APC	R&D	FAB2585A
CD90 PE	BD	555596
HLA ABC APC	BD	555555
CD105 FITC	Ancell	326-040
HLA DR APC	BD	559866
CD56 PE	BD	555516
CD73 PE	BD	550257
CD31 FITC	BD	555445
CD133 PE	miltenyi	130-090-853
PDGF-r	R&D	mab 1263
mouse IgG1 FITC	BD	345815
mouse IgG1 PE	BD	345816
mouse IgG1 APC	BD	345818
IgG2b PE	BD	555743
goat anti mouse PE	Dako	R0480
sodium azide	Merck	822335
DMEM Ham’s F12	Gibco	31331-028
ITS (insul, transferrin, selenium)	Sigma	I1884
hydrocortisone	Sigma	H0135
triiodothyrinine	Sigma	T5516
epidermal growth factor	sigma	E9644
Immortalized human renal PTEC (HK2)			courtesey of M. Ryan, university college Dublin