Her præsenterer vi en roman kliniske grade isolation og kultur metode for nyre Perivascular stromale celler (kPSCs) baseret på hele orglet perfusion med fordøjelsesenzymer og NG2-celle berigelse. Med denne metode er det muligt at erhverve tilstrækkeligt celle numre for cellulære terapi.
Mesenchymale stromale celler (MSCs) er væv homeostatiske og immun modulerende celler, der har vist positive effekter i nyresygdomme og transplantation. Perivascular stromale celler (PSC) deler egenskaber med knoglemarv MSCs (bmMSCs). Men de også besidder, sandsynligvis på grund af lokale prægning, væv-specifikke egenskaber og spille en rolle i lokale væv homøostase. Dette væv specificitet kan resultere i væv specifikke reparation, også inden for den menneskelige nyrerne. Tidligere viste vi, at menneskelige nyre PSC’er (kPSCs) har udvidet nyre epitelial sårheling der henviser til, at bmMSCs ikke har dette potentiale. KPSCs kan desuden forbedre nyre skade in vivo. Derfor, kPSCs er en interessant informationskilde for Celleterapi, især for nyresygdomme og renal transplantation. Her viser vi de detaljerede isolation og kultur metode for kPSCs fra transplantation-grade menneskelige nyrer baseret på hele-orgel perfusion af fordøjelsesenzymer via nyrearteriestenose og berigelse for perivascular markøren NG2. På denne måde, kan være fremstillet store celle mængder, der er egnet til cellulære terapi.
Mesenchymale stromale celler (MSCs) er modulerende immunceller, der blev oprindeligt isoleret fra knoglemarven. De er kendetegnet ved deres spindel formet morfologi, evnen til at skelne i fedt, knogle og brusk og overholdelse af plast. MSC’er express stromale markører CD73, CD90, CD105 samtidig med at være negativ for markører CD31 og CD451,2,3. MSC’er er en lovende kandidat til celleterapi på grund af deres væv homeostatiske og immunmodulerende kapacitet. bmMSCs er i øjeblikket undersøgt i kliniske forsøg for flere sygdomme, herunder nyresygdomme og nyre transplantation som gennemgik andetsteds4.
Tidligere var det vist at perivascular celler fra flere forskellige fast organer, herunder fedtvæv, moderkagen og skeletmuskulatur deler egenskaber med MSCs9. Men, disse celler også udviser væv-specifikke funktioner, som kan resultere i organotypic reparation10. Menneskelige myokardiets perivascular celler, for eksempel, stimuleret angiogene svar efter hypoxi og opdeles i cardiomyocytes, mens perivascular celler isoleret fra andre væv ikke vise disse potentialer11.
Perivascular stromale celler kan også isoleres fra mus12,13,14 og menneskelige nyre15,16. Vi grundigt karakteriseret kPSCs og sammenlignet disse til bmMSCs. Vi fandt, at kPSCs, svarende til bmMSCs, har immunosuppressive kapacitet og kan støtte vaskulær plexus dannelse. Der er dog væv specifikke forskelle mellem celletyper, som kPSCs viste en organotypic transcriptional udtryk signatur, herunder nefrogen transskriptionsfaktorer HoxD10 og HoxD11. kPSCs, i modsætning til bmMSCs, undergår ikke myofibroblast transformation efter stimulation med TGF-β og var ude af stand til at differentiere i adipocytter. Derudover accelererede kPSCs epitelial integritet i en nyre rørformede epitelial sår scratch assay, et fænomen, der ikke blev observeret med bmMSCs. Denne forbedrede sår reparation var medieret gennem hepatocyt vækstfaktor frigivelse. Desuden forbedret kPSCs nyre skade i en musemodel af akutte nyre skade15. Derfor kPSCs synes at have superior renal reparation kapacitet og er en interessant ny kilde til celleterapi i nyresygdomme.
For at kunne bruge kPSCs til celle terapi formål, bør kPSCs være isoleret i en kliniske grade måde med kliniske grade enzymer og protokoller. Desuden, for at være i stand til at behandle flere patienter med kPSCs fra 1 donor, tilstrækkelig celle numre bør opnås. Her viser vi i detaljer, proceduren kliniske grade isolation af kPSCs fra hele transplantation grade nyrer, giver tilstrækkeligt antal celler skal bruges til klinisk cellulære terapi.
Perivascular celler er blevet isoleret fra mange forskellige menneskelige fast organer, herunder bugspytkirtlen, fedt, brusk og nyre9,15,16. De fleste metoder, men er baseret på små prøver af væv, som er dissekeret og bagefter behandlet med fordøjelsesenzymer. Det er desuden normalt ikke udføres med kliniske grade produkter. Dette gør disse strategier mindre egnet til direkte kliniske oversættelse hvor store mængder af klinisk-grade celler er nødvendige.
Her viser vi en roman isolation metode af menneskelige kPSCs for hele organer baseret på perfusion med kliniske grade enzymer og materialer. Protokollen er tilpasset fra den kliniske Holme af Langerhanske isolation protokol i øjeblikket i brug for klinisk anvendelse i vores center18.
Dette er den første kliniske grade metode, hvor store mængder af kPSCs kan opnås. Variation i celle udbytte er stort set donor afhængige. Når cellen udbytte vi i øjeblikket få fra en brøkdel af rå cellesuspension af tre forskellige donorer er ekstrapoleres, i teorien, opnås imidlertid en gennemsnitlige afkast på 2,7 x 1012 kPSCs per donor. Som MSC terapi består typisk af 2 celle infusioner med 1-2 x 106 celler/kg krop vægt4, er disse celle numre tilstrækkelig for allogen behandling af flere patienter.
Et kritisk trin i proceduren isolation er varigheden af collagenase fordøjelsen. Når perioden fordøjelsen er for kort, forbliver store klumper af væv, som vil være sværere at kultur. Når perfusion er alt for lang, kan øget celledød observeres. Derfor, så snart nyren begynder at blive bløde og mindre gennemsigtig væske, nyrerne bør være masseres forsigtigt og collagenase behandlingen bør stoppes.
En anden kritisk trin er kulturen i cellerne efter NG2 celle berigelse. Nogle gange efter den NG2 celle berigelse begynder perivascular celler ikke at formere eller begynder at vokse i 3D strukturer. I dette tilfælde, når cellerne er trypsinized og tilsås, vil cellerne normalt begynder at vokse i éncellelag kultur.
Som udgangspunkt materiale, blev menneskelig transplantation grade nyrerne kasseret hovedsageligt for kirurgisk grunde brugt. Disse er funktionelle organer uden større fibrose. Vi anerkender, at dette kunne være en begrænsning, da dette er en forholdsvis sjælden og svært at få orgel kilde. Eksplanterede nyrerne kan være en anden kilde; men afhængigt af grunden af nyre explantation, disse nyrer kan indeholde flere fibrose og dermed myofibroblasts, og derfor omhu bør tages, da myofibroblasts kan være isoleret og kulturperler i stedet for perivascular celler.
Som kPSCs isoleret med denne protokol Vis organo-mest egenskaber med nyre epitelial sår healing kapacitet15, celleterapi med kPSCs i nyresygdomme og transplantation vil være en interessant fremtidig anvendelse. Til dette formål er der flere strategier i cellen/cellerne produkt levering. Den første strategi er IV infusion af kPSCs, som anvendes i øjeblikket i de kliniske undersøgelser, bmMSC. En anden interessant program er brugen af kPSCs eller kPSC-udskilles faktorer i maskinen perfusion før transplantation. På denne måde, kan kvaliteten af det eksplanterede nyre forbedre, som kunne føre til forbedret nyrefunktion efter transplantation. For begge strategier er kPSCs en interessant ny celle kilde til yderligere at udforske til kliniske formål.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning har modtaget støtte fra Det Europæiske Fællesskabs syvende ramme-Program (FP7/2007-2013) under grant aftalenummer 305436 STELLAR.
Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 days is used | |
platelet lysate | custom made | ||
Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
500ml PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
transfusion system | Codan | 455609 | |
DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
normal human serum | Sanquin | ||
Hepes 1M | Lonza | BE-17-737E | |
NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
CaCl2 1M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
UW | Bridge to life | 32911 | |
Heparin | Leo Pharma | ||
collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
pump head | metrohm | x077202600 | |
perfusion tray | custom made | ||
LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
pulmozyme | Roche | ||
culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
Trypsin | sigma | t4174 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
cellstrainer 70 µm | Corning | 352350 | |
LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
CD34 FITC | BD | 555821 | |
CD45 APC | BD | 555485 | |
CD146 PE | BD | 550315 | |
NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
CD90 PE | BD | 555596 | |
HLA ABC APC | BD | 555555 | |
CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
HLA DR APC | BD | 559866 | |
CD56 PE | BD | 555516 | |
CD73 PE | BD | 550257 | |
CD31 FITC | BD | 555445 | |
CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
IgG2b PE | BD | 555743 | |
goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
sodium azide | Merck | 822335 | |
DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
ITS (insul, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
epidermal growth factor | sigma | E9644 | |
Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |