Examen échocardiographique et histologique de morphologie cardiaque chez la souris
Summary
L’examen échocardiographique est fréquemment utilisée chez les souris. Appareils à ultrasons à haute résolution coûteux ont été développés à cet effet. Ce protocole décrit une procédure échocardiographique abordable combinée avec histologique morphométrique des analyses pour déterminer la morphologie cardiaque.
Abstract
Un nombre croissant de modèles de souris génétiquement modifiées sont apparues ces dernières années. En outre, le nombre d’études pharmacologiques réalisées chez la souris est élevé. Caractérisation phénotypique de ces modèles murins nécessite également l’examen de la fonction cardiaque et de la morphologie. L’échocardiographie et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) sont des méthodes couramment utilisées pour caractériser la fonction cardiaque et la morphologie chez la souris. Échocardiographiques et IRM des équipements spécialisés pour utilisation dans les petits rongeurs est coûteuse et nécessite un espace dédié. Ce protocole décrit les mesures cardiaques chez des souris en utilisant un système échocardiographique clinique avec une sonde vasculaire humaine de 15 MHz. Des mesures sont effectuées sur des souris adultes anesthésiés. Au moins trois séquences d’images sont enregistrées et analysées pour chaque animal en mode M dans la vue de court-axe parasternale. Par la suite, un examen histologique cardiaque est effectué et cardiomyocyte diamètres sont déterminés sur l’hématoxyline-éosine – ou germe de blé agglutinine (WGA)-paraffine coupes colorées. Densité de navire est déterminée morphométrique après immunomarquage Pecam-1. Le protocole a été appliquées avec succès à des études pharmacologiques et différentes génétiques des modèles animaux en conditions basales, ainsi qu’après infarctus expérimental par la ligature permanente de la gauche (d’artère coronaire descendante antérieure DAL). Dans notre expérience, étude échocardiographique est limitée aux animaux anesthésiés et est réalisable chez la souris adulte pesant au moins 25 g.
Introduction
Il existe une grande variété de modèles de souris génétiquement modifiées, et le nombre d’études pharmacologiques chez la souris est élevée1,2. Échographie et l’IRM sont des méthodes couramment utilisées pour la caractérisation phénotypique de la fonction cardiaque et de la morphologie chez ces souris modèles3. Le protocole présenté vise à analyser la fonction cardiaque et la morphologie chez la souris adulte. Il combine échocardiographiques, histologiques et immunohistochemical des mesures. L’examen échocardiographique est employé couramment dans la souris4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachon et al. 11 identifié 205 études publiées dans Circulation, Circulation Research, American Journal of Physiology – coeur et la physiologie circulatoireet Recherche cardiovasculaire entre 2012 et 2015 qui a utilisé un examen échocardiographique chez les animaux.
L’échocardiographie est utilisé pour identifier des phénotypes cardiaques chez les souris génétiquement modifiées5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, ainsi qu’analyser la fonction cardiaque chez l’hypertrophie chronique induite par la surcharge, l’ischémie myocardique et les modèles de cardiomyopathie chez la souris (évaluées à12). Équipement d’échocardiographie améliorée permet à la la mesure standard du ventricule gauche (LV) systoliques et diastoliques dimensions, Doppler tissulaire, échographie de contraste myocardique et l’évaluation de la fonction régionale de LV et réserve coronarienne 12. idéalement, l’examen échocardiographique doit être effectué chez des souris conscientes afin d’éviter les effets négatifs de l’anesthésie sur la fonction contractile, système nerveux autonome contrôle réflexe, et11la fréquence cardiaque. Néanmoins, cette approche est limitée par l’obligation de former les animaux ; difficultés à maintenir la température du corps stable ; artefacts de mouvement ; stress ; très hautes fréquences cardiaques ; et l’exigence d’au moins deux chercheurs réaliser l’expérience, en particulier si un grand nombre d’animaux est incriminés. Fait intéressant, une étude récente a indiqué aucune différence des paramètres échocardiographiques chez des animaux entraînés et inexpérimentées de19. Nous effectuons des mesures échocardiographiques chez les souris anesthésiés. Protocoles d’anesthésie différents seront discutés ci-dessous.
Bien que l’échocardiographie résolution standard (> 10 MHz) est suffisante pour mesurer LV systolique et diastoliques dimensions et la fonction cardiaque chez la souris adulte, la méthode est limitée dans sa description des phénomènes structurels sous-jacents. Ainsi, nous combinons les mesures in vivo avec histologique et immunohistological analyses pour mesurer, par exemple, densité de diamètre et navire cardiomyocyte. Autres études histologiques et immunohistological, telles que la détermination de la prolifération, l’examen de l’apoptose, mesures de taille d’infarctus, détermination de la fibrose et l’expression des marqueurs spécifiques, peuvent également être effectuées sur le même type de traité des tissus mais ne font pas l’objet du présent protocole. La combinaison de in vivo l’examen échocardiographique avec analyse histologique permet de mieux comprendre supplémentaires altérations structurelles sous-jacentes. Dans une étape supplémentaire, nous pouvons compléter ces mesures par des études moléculaires et ultra-structurale. Des analyses histologiques non seulement terminer l’examen échocardiographique mais également devient indispensables lorsque la résolution de l’échocardiographie n’est pas suffisante. C’est particulièrement le cas dans les modèles de souris génétiquement modifiées qui sont embryonnaires létale23,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Différentes méthodes ont été développées pour évaluer la structure cardiaque et la fonction chez les souris, y compris l’échocardiographie, renforcement du contraste MRI, micro CT et PET scan. En raison de son rapport coût/efficacité et simplicité, échocardiographie est la technique plus largement utilisée pour l’analyse fonctionnelle de souris11. En général, en raison de la petite taille du cœur et la haute fréquence de la fréquence cardiaque chez les souris, les transducteu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travaux ont été subventionnés par le gouvernement Français (Agence nationale de la recherche, ANR) grâce au programme « Investissements pour l’avenir » LABEX SIGNALIFE (référence ANR-11-LABX-0028-01) et de grâce à des subventions et K. d. W. de l’Association pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France et le Plan Cancer Inserm. D. B. et V. a. reçu des bourses de la Fondation pour la Recherche Médicale et de la ville de Nice, respectivement. Les échographies cardiaques et le capteur ont été gracieusement fournies par Philips. Nous remercions A. Borderie, S. Destrée, M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, Martres A., A. Biancardini et S. M. Wagner pour leur aide technique qualifié.
Materials
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
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