Examen ecocardiográfico e histológico de la morfología cardiaca en el ratón
Summary
La examinación ecocardiográfica se utiliza con frecuencia en los ratones. Dispositivos de ecografía de alta resolución caro han sido desarrollados para este propósito. Este protocolo describe un procedimiento ecocardiográfico asequible combinado con análisis de morfometría histológica para determinar la morfología cardiaca.
Abstract
Un creciente número de modelos de ratón modificados genéticamente se ha convertido en disponible en los últimos años. Por otra parte, el número de los estudios farmacológicos realizados en ratones es alta. Caracterización fenotípica de estos modelos de ratón también requiere el examen de la morfología y la función cardiaca. La ecocardiografía y la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) son métodos utilizados para caracterizar la función cardiaca y morfología en ratones. Equipo ecocardiográfico y MRI especializado para uso en pequeños roedores es costoso y requiere un espacio dedicado. Este protocolo describe mediciones cardiacas en ratones usando un sistema ecocardiográfico clínico con una sonda vascular humano 15 MHz. Las mediciones se realizan en ratones adultos anestesiados. Al menos tres secuencias de imágenes se registran y se analizan para cada animal en modo M en la vista de eje corto paraesternal. Luego, la examinación histológica cardíaca se lleva a cabo, y cardiomiocitos diámetros se determinan con hematoxilina-aglutinina eosina o germen de trigo (WGA)-tinción de secciones de la parafina. Densidad del barco es determinada morfométricamente immunostaining de Pecam-1. El protocolo ha sido aplicados con éxito a los estudios farmacológicos y diferentes genética los modelos animales bajo las condiciones iniciales, así como después de infarto experimental por la ligadura permanente de la izquierda (anterior) de la arteria coronaria descendente CHAVAL). En nuestra experiencia, investigación ecocardiográfica se limita a los animales anestesiados y es factible en ratones adultos pesa por lo menos 25 g.
Introduction
Una gran variedad de modelos de ratón modificados genéticamente están disponibles, y el número de los estudios farmacológicos en ratones es alta1,2. Ecocardiografía y MRI son métodos utilizados para la caracterización fenotípica de la función cardiaca y la morfología de estos modelos de mouse3. El protocolo presentado pretende analizar la función cardiaca y morfología en ratones adultos. Combina ecocardiográfica, histológicos, immunohistochemical y. La examinación ecocardiográfica es ampliamente utilizada en ratones4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachón et al. 11 identificó 205 estudios publicados en circulación, la Investigación de circulación, Revista americana de fisiología – fisiología circulatoria y corazóne Investigación Cardiovascular entre 2012 y 2015 utilizan la examinación ecocardiográfica en animales.
La ecocardiografía se utiliza para identificar fenotipos cardíacos en ratones modificados genéticamente5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, así como para analizar la función cardiaca en hipertrofia inducida por sobrecarga crónica, isquemia miocárdica y cardiomiopatía modelos en ratones (revisados en12). Equipo de ecocardiografía mejorada permite la medida estándar de ventricular izquierda (LV) sistólicas y diastólicas dimensiones, Doppler tisular, ecografía de contraste miocárdico y la evaluación de la función regional del VI y reserva coronaria 12. idealmente, la examinación ecocardiográfica debe realizarse en ratones conscientes para evitar los efectos negativos de la anestesia sobre la función contráctil, control reflejo autonómico, y ritmo cardíaco11. Sin embargo, este enfoque está limitado por la necesidad de entrenar a los animales; dificultades para mantener la temperatura corporal estable; artefactos de movimiento; estrés; frecuencias cardíacas muy altas; y el requisito de al menos dos investigadores para llevar a cabo el experimento, especialmente si un gran número de animales está bajo investigación. Curiosamente, un estudio reciente divulgó ningunas diferencias en parámetros ecocardiográficos en animales entrenados y no entrenados19. Realizamos las mediciones ecocardiográficas en ratones anestesiados. Protocolos de anestesia diferentes se discutirá a continuación.
Aunque la ecocardiografía de resolución estándar (> 10 MHz) es suficiente para medir LV sistólico y diastólicas dimensiones y función cardiaca en ratones adultos, el método es limitado en su descripción de los fenómenos estructurales subyacentes. Por lo tanto, combinamos las mediciones en vivo con histológicos y análisis immunohistological para medir, por ejemplo, la densidad diámetro y buque de cardiomiocitos. Otras investigaciones histológicas e immunohistological, tales como la determinación de la proliferación, la examinación de apoptosis, medidas del tamaño del infarto, la determinación de la fibrosis y la expresión del marcador específico, también se pueden realizar en el mismo tipo de procesado del tejido, pero no son objeto del presente Protocolo. La combinación de en vivo la examinación ecocardiográfica con análisis histológicos ofrece ideas adicionales sobre alteraciones estructurales subyacentes. En un paso adicional, podemos completar estas medidas con investigaciones moleculares y ultraestructurales. Análisis histológicos no sólo completan la examinación ecocardiográfica pero también se convierten en indispensables cuando la resolución de la ecocardiografía no es suficiente. Esto es especialmente el caso en modelos de ratones modificados genéticamente que son letales embrionarios23,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han desarrollado diferentes métodos para evaluar la estructura cardiaca y la función en los ratones, incluyendo ecocardiografía, poner en contraste-realzado MRI, micro CT y PET scan. Debido a su eficacia y simplicidad, la ecocardiografía es la técnica más ampliamente utilizada para el análisis funcional en ratones11. En general, debido al pequeño tamaño del corazón y el de alta frecuencia del ritmo cardíaco en ratones, transductores con una frecuencia de > debe utilizarse 10 MHz,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por el gobierno francés (Agencia Nacional de investigación, ANR) a través del programa de “Inversiones para el futuro” LABEX SIGNALIFE (referencia ANR-11-LABX-0028-01) y por donaciones a K. W. D. de la Asociación pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France y Plan de cáncer Inserm. D. B. y a. V. recibieron becas de la Fundación pour la Recherche Médicale y de la ciudad de Niza, respectivamente. La ecocardiografía transesofágica y el transductor fueron amablemente proporcionados por Philips. Agradecemos A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, Martres A., A. Biancardini y S. M. Wagner por su ayuda técnica especializada.
Materials
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
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