Vi har utviklet en romanprotokoll for å studere heterocellulær populasjonsdynamikk som respons på forstyrrelser. Dette manuskriptet beskriver en bildebasert plattform som produserer kvantitative datasett for samtidig karakterisering av flere cellulære fenotyper av heterocellulære populasjoner på en robust måte.
Cellular prosesser er komplekse og skyldes samspillet mellom flere celletyper og deres miljø. Eksisterende cellebiologi teknikker tillater ofte ikke nøyaktig tolkning av dette samspillet. Ved hjelp av en kvantitativ bildebasert tilnærming presenterer vi en høyinnholdsprotokoll for å karakterisere de dynamiske fenotypiske responsene ( dvs. morfologiske endringer, proliferasjon, apoptose) av heterogene cellepopulasjoner til endringer i miljøstimuli. Vi markerer vår evne til å skille mellom celletyper basert på enten fluorescensintensitet eller iboende morfologiske funksjoner, avhengig av applikasjonen. Denne plattformen tillater en mer omfattende karakterisering av subpopulasjonsrespons på forstyrrelser mens man bruker kortere tid, mindre mengder reagenser og lavere sannsynlighet for feil enn tradisjonelle cellebiologiske analyser. I noen tilfeller kan imidlertid cellepopulasjoner være vanskelige å identifisere og kvantifisere basert på kompleks celluLar funksjoner og vil kreve ekstra feilsøking; Vi fremhever noen av disse omstendighetene i protokollen. Vi demonstrerer denne applikasjonen ved hjelp av respons på stoff i en kreftmodell; Det kan imidlertid lett brukes mer bredt til andre fysiologiske prosesser. Denne protokollen tillater en å identifisere subpopulasjoner innenfor et samkultur system og karakterisere den spesielle responsen til hver til eksterne stimuli.
Cellbaserte analyser har vært en arbeidshest i grunnleggende forsknings- og stoffutviklingsinnstillinger. Begrensningene i disse standardanalysene har imidlertid blitt tydeligere med uoverensstemmelsen mellom in vitro og kliniske data og sviktet i de fleste medisiner for å motta FDA-godkjenning. Her presenterer vi en ny metode for utnyttelse av kvantitativ bildebehandling for samtidig å analysere heterocellulære fenotyper som respons på relevante, sammenfallende miljøstimuli.
Tradisjonelle cellebaserte analyser som brukes til å måle celle-levedyktighet inkluderer: trypanblå ekskluderingsanalyser, MTT / MTS og Annexin V-FITC-flowcytometri-farging. Trypan Blue Exclusion-analyser, mens de er enkle og billige, krever et stort antall celler, er tidkrevende, og er ofte påvirket av brukerforstyrrelser 1 . MTT- og MTS-analyser måler indirekte celle-levedyktighet gjennom målinger av mitokondriell metabolisk hastighet. Men den metabolske aktiviTy av celler kan påvirkes av forskjellige kulturbetingelser (som media eller oksygenkonsentrasjon), noe som fører til unøyaktige resultater og forhindrer standardisering over celletyper og forhold 2 , 3 . En annen stor ulempe ved disse teknikkene er deres manglende evne til å skille mellom flere celletyper – de fleste biologiske systemer er heterocellulære. Selv om strømningscytometri-metoder har mulighet til å skille mellom flere cellepopulasjoner, er det nødvendig med celleetiketter, dynamisk prøvetaking er utfordrende, og når du bruker vedhæftende celler, blir denne applikasjonen tidkrevende og feilproblemer.
Andre viktige cellulære fenotyper, inkludert morfologiske forandringer, forekommer som respons på miljøstimuli, men er ikke fanget av tradisjonelle cellebaserte analyser. Profiling celle stater gjennom morfologisk karakterisering og kartlegging likheter over prøver er et kraftig, upartisk verktøy med aEvne til å gi ny innsikt i mange aspekter av grunnleggende og translationell forskning, inkludert grunnleggende cellebiologi og legemiddelfunn 4 . Videre har tumorcellemorfologi vist seg å korrelere med tumor subtypes 5 og aggressivitet 6 . Det er derfor av stor interesse å studere disse cellulære funksjonene og hvordan de relaterer seg til spesifikke miljøforstyrrelser. I tillegg kan man bruke forskjeller i morfologiske egenskaper for å diskriminere mellom subpopulasjoner i medkultursystemer. Fluorescensmerkende celler har nedfall ( dvs. endring av inneboende celleegenskaper, tidkrevende) og derfor er ytterligere metoder for å klassifisere celletyper fordelaktige.
Mikroskopibasert bildebehandling er en alternativ metode for profilering av cellulære fenotyper på en multiplekset, kvantitativ og robust måte. I dette manuskriptet bruker vi vår kvantitative bildebehandlingsrørledning for å markere evolutioNary dynamikk av heterogene cellepopulasjoner i en tumor. Vi fokuserer på samspillet mellom ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) -celler og kreft-assosierte fibroblaster (CAF), den mest utbredte stromalcelletypen som finnes i svulster. CAF har blitt implicert i tumorinduksjon, progresjon og terapeutisk respons; Derfor kan utførelse av fenotypiske analyser på tumorceller i fravær av CAFs være misvisende 7 , 8 , 9 . Spesifikt vurderte vi effekter av CAF på tumorceller som respons på erlotinib, et lite molekyl som målretter mot Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) som ofte brukes i klinisk behandling av NSCLC. Vi benyttet en high-end screening plattform og den tilhørende bildeanalysen programvare for evaluering; Men i et forsøk på å gjøre denne metoden tilgjengelig for andre forskere har vi også utviklet en sammenlignbar nedstrømsprotokoll ved hjelp av open source-programvaren:CellProfiler 10 og CellProfiler Analyst 11 . De fleste bildebaserte høyindholdsscreeningsanalyser analyseres med kommersialisert programvare som er spesifikk for en gitt instrumentmodell. Resultatene er vanskelige å replikere i andre laboratorier med annen programvare fordi de underliggende algoritmene ofte er proprietære. Ved bruk av denne bildebaserte pipeline ble celleproliferasjon, død og morfologi for hver subpopulasjon av en heterocellulær kultur som respons på medikamentbehandling ved bruk av både fluorescens- og morfologibasert klassifisering målt. Følgende protokoll gir en robust metode for å undersøke komplekse cellulære prosesser.
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Cancer Institute (NCI) Grants U54CA143798 og U54CA143907 for å etablere Fysisk Vitenskap-Oncology Centers (PS-OCs) ved henholdsvis Dana-Farber Cancer Institute og University of Southern California. SM Mumenthaler mottok en PS-OC transnetwork-pris som støttet noe av dette arbeidet.
Vi ønsker å uttrykke vår dypeste takknemlighet til våre filantropiske tilhørere, spesielt Stephenson-familien, Emmet, Toni og Tessa, for deres donasjon av Operetta HCS-plattformen. Vi vil også takke J. Foo for veiledning, og senter for anvendt molekylærmedisinteam: D. Agus for klinisk veiledning og mentorskap, K. Patsch for meningsfulle diskusjoner med eksperimentell design, R. Rawat for hjelp i bildeanalyseprotokoller , J. Katz for teknisk assistanse med operettaen, og P. Macklin og D. Ruderman for nyttige diskusjoner og tilbakemeldinger.
RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |