Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu
Summary
Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır.
Abstract
Hücresel süreçler karmaşıktır ve çoklu hücre tipleri ve çevreleri arasındaki etkileşim sonucunda ortaya çıkmaktadır. Mevcut hücre biyolojisi teknikleri çoğu zaman bu etkileşimin doğru yorumlanmasına izin vermez. Kantitatif görüntüleme tabanlı bir yaklaşım kullanarak, heterojen hücre popülasyonlarının dinamik fenotipik tepkilerini ( yani morfoloji değişiklikleri, çoğalması, apoptozisi) çevre uyaranlarındaki değişikliklere karakterize etmek için yüksek içerikli bir protokol sunuyoruz. Uygulamaya bağlı olarak, flüoresan yoğunluğuna veya doğal morfoloji özelliklerine dayalı hücre tiplerini ayırt etme yeteneğimizi vurguluyoruz. Bu platform, geleneksel hücre biyolojisi tahlillerine kıyasla daha kısa süreler, daha az reaktif miktarı ve hata olasılığı düşük iken pertürbasyona alt popülasyon yanıtının daha kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, bazı vakalarda, hücre popülasyonlarının belirlenmesi zor olabilir ve karmaşık cellu bazında nicelendirilebilirDaha fazla sorun giderme gerektirecektir; Protokolde bu koşulların bazılarını vurguluyoruz. Bu uygulamayı bir kanser modelinde uyuşturucuya tepki kullanarak göstermek; Bununla birlikte, diğer fizyolojik süreçlere daha kolay uygulanabilir. Bu protokol, bir ortak kültür sistemi içinde alt popülasyonları tanımlamaya ve her ikisinin de dış uyaranlara verilen tepkileri karakterize etmesine izin verir.
Introduction
Hücre bazlı tahliller, temel araştırma ve ilaç geliştirme ayarlarında önemli bir yere sahiptir. Bununla birlikte, bu standart tayinlerin sınırlamaları, in vitro ve klinik veriler arasındaki uyumsuzluk ve çoğu ilaçların FDA onayını almaması nedeniyle giderek daha belirgin hale gelmiştir. Burada, eşzamanlı olarak ortaya çıkan çevre uyarılarına yanıt olarak heterosellüler fenotipleri eş zamanlı olarak analiz etmek için kantitatif görüntülemenin kullanılması için yeni bir yöntem sunuyoruz.
Hücrenin yaşayabilirliğini ölçmek için kullanılan geleneksel hücre bazlı tahliller şunları içerir: tripan mavisi dışlama testleri, MTT / MTS ve Annexin V-FITC akış sitometrisi boyaması. Tripan mavisi dışlama testleri, basit ve ucuz olsa da, çok sayıda hücre gerektirir, zaman alıcıdır ve genellikle kullanıcı tarafından önyargılanmadan etkilenir 1 . MTT ve MTS tahlilleri, mitokondriyal metabolik hız ölçümleri yoluyla dolaylı olarak hücre yaşayabilirliğini ölçer. Bununla birlikte, metabolik aktiviteHücrelerin türleri, yanlış sonuçlara yol açan ve hücre tipleri ve koşulları 2 , 3'te standartlaşmayı önleyen farklı kültür koşullarından (örneğin, ortam veya oksijen konsantrasyonu) etkilenebilir. Bu tekniklerin bir başka büyük dezavantajı, çoklu hücre tiplerini ayırt edememeleridir – çoğu biyolojik sistem heterosellülerdir. Akış sitometrisi yöntemleri çoklu hücre popülasyonları arasında ayırt etme yeteneğine sahipken, hücre etiketleri gereklidir, dinamik örnekleme zorludur ve yapışkan hücreler kullanıldığında bu uygulama zaman alıcı ve hata eğilimli hale gelir.
Morfolojik değişiklikler de dahil olmak üzere diğer önemli hücresel fenotipler, çevresel uyaranlara yanıt olarak ortaya çıkar ancak geleneksel hücre bazlı tahliller tarafından yakalanmaz. Hücre durumlarını morfolojik karakterizasyon yoluyla profilleme ve benzerliklerini örnekler arasında haritalama,Temel hücre biyolojisi ve ilaç keşfi de dahil olmak üzere temel ve translasyonel araştırmaların birçok yönüne yeni anlayışlar kazandırmak. Ayrıca, tümör hücresi morfolojisinin tümör alt tipi 5 ve saldırganlık 6 ile korele olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla, bu hücresel özellikleri ve bunların belirli çevresel rahatsızlıklarla nasıl ilişkili olduklarını incelemek çok önemlidir. Ek olarak, ortak kültür sistemlerinde alt popülasyonlar arasında ayrım yapmak için morfolojik özelliklerin farklılıklarını kullanabilir. Floresan olarak etiketlenen hücrelerin düşüşleri vardır ( yani doğal hücre özelliklerini değiştirerek zaman alıcıdır) ve bu nedenle hücre tiplerini sınıflandırmak için ilave yöntemler avantajlıdır.
Mikroskopi tabanlı görüntüleme, hücresel fenotipe çok katlı, kantitatif ve sağlam bir şekilde profil oluşturmada alternatif bir yöntemdir. Bu el yazmasında, nicel görüntüleme hattını, evriminBir tümör içindeki heterojen hücre popülasyonlarının nary dinamikleri. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) hücreleri ile tümörlerde bulunan en yaygın stromal hücre türü Kanserle İlişkili Fibroblastlar (CAF) arasındaki etkileşime odaklanırız. CAF'ler tümörün başlatılması, ilerlemesi ve terapötik tepki ile ilişkilendirilmiştir; Bu nedenle CAFs yokluğunda tümör hücreleri üzerinde fenotipik analizler yapmak 7 , 8 , 9 yanıltıcı olabilir. Özellikle, KKH'lerin klinik tedavisinde sıklıkla kullanılan Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörünü (EGFR) hedefleyen küçük bir molekül olan erlotinib'e yanıt olarak CAF'lerin tümör hücreleri üzerindeki etkilerini değerlendirdik. Değerlendirme için yüksek içerikli bir tarama platformu ve eşlik eden görüntü analiz yazılımını kullandık; Bununla birlikte, bu metodolojiyi diğer araştırmacılar tarafından erişilebilir kılmaya yönelik bir girişimde, açık kaynaklı yazılımları kullanarak karşılaştırılabilir bir aşağı akış protokolü geliştirdik:CellProfiler 10 ve CellProfiler Analisti 11 . Çoğu görüntü tabanlı yüksek içerikli tarama testleri, belirli bir enstrüman modeline özgü ticarileştirilmiş yazılımlarla analiz edilir. Altta yatan algoritmalar genellikle tescilli olduğundan sonuçları farklı yazılımlarla diğer laboratuvarlarda çoğaltmak zordur. Bu görüntü temelli boru hattını kullanarak, her iki floresans ve morfoloji bazlı sınıflandırmayı kullanarak, ilaç tedavisine yanıt olarak bir heterosellüler kültüre ait her bir alt popülasyonun hücre çoğalması, ölümü ve morfolojisi ölçülmüştür. Aşağıdaki protokol karmaşık hücresel proseslerin problanması için sağlam bir metodoloji sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma sırasıyla Dana-Farber Kanser Enstitüsünde ve Güney Kaliforniya Üniversitesi'nde Fiziksel Bilimler-Onkoloji Merkezleri (PS-OC) kurmak üzere U54CA143798 ve U54CA143907 Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Grants tarafından finanse edildi. SM Mumenthaler, bu çalışmaların bir kısmını destekleyen bir PS-OC trans-network ödülü aldı.
Operetta HCS platformunu bağışları için hayırsever taraftarlarımıza, özellikle Stephenson ailesi, Emmet, Toni ve Tessa'ya en büyük şükranlarımızı sunmak istiyoruz. Rehberlik için J. Foo'ya ve Uygulamalı Moleküler Tıp Merkezi ekip üyelerine de teşekkür ederiz: D. Agus klinik rehberlik ve mentorluk için, K. Patsch deneysel tasarım ile anlamlı tartışmalar için R. Rawat, görüntü analiz protokollerinde yardım için , J. Katz, Operetta ile teknik yardım için, ve P. Macklin ve D. Ruderman'a yararlı tartışmalar ve geri bildirimler.
Materials
| RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
| FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
| TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
| TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
| 96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
| Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
| DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
| Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
| Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
| Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
| CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
| Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
| 15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |
References
- Kanemura, Y., et al. Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity. J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).
- Hsu, S., et al. Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes. J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).
- Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. Applications in image-based profiling of perturbations. Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).
- Sero, J. E., et al. Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells. Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).
- Chen, J. F., et al. Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases. Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Paraiso, K. H., Smalley, K. S. Fibroblast-mediated drug resistance in cancer. Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).
- Dao, D., et al. CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets. Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).
- Garvey, C. M., et al. A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics. Sci Rep. 6, 29752 (2016).
- Juarez, E. F., et al. Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD. BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).
- Mumenthaler, S. M., et al. The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells. Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).
