혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법
Summary
혈액 뇌 장벽의 범위를 유지하는 것은 중추 신경계의 항상성을 유지하기위한 열쇠입니다. 이 프로토콜은 혈액 – 뇌 장벽 범위를 조정하는 근본적인 병적 과정을 묘사하는 체외 기술을 설명합니다.
Abstract
Blood-brain barrier (BBB) 범위는 중추 신경계 (CNS)의 항상성에 중요한 역할을합니다. BBB는 성상 세포, 혈관 주위 세포 및 뇌 내피 세포 (BECs)에 의해 동적으로 유지됩니다. 여기, 우리는 불멸의 인간 BEC의 단일 문화, 기본 마우스 BEC의 단일 문화, BBB의 인간화 트리플 문화 모델 (BECs, astrocytes 및 pericytes)를 사용하여 BBB 범위를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다. 질병 상태에 대한 분석법의 적용 가능성을 강조하기 위해 우리는 BBB 적용 범위에서 알츠하이머 병 (AD) 진행에 중요한 기여를하는 oligomeric amyloid-β (oAβ)의 효과에 대해 설명합니다. 또한 우리는이 기술의 약물 스크리닝 가능성을 조명하기 위해 표피 성장 인자 (EGF)를 이용합니다. 우리의 결과는 단일 및 삼중 배양 BECs은 기초 조건 하에서 meshwork와 같은 구조를 형성하고, oAβ는이 세포 망 조직 형성을 방해하고 예비 형성된 메쉬 구조를 퇴화시키고,EGF는 이러한 혼란을 차단합니다. 따라서 기술 된 기술은 BBB 적용 범위를 조절하는 근본적이고 질병 관련 프로세스를 해부하는 데 중요합니다.
Introduction
대뇌 모세 혈관의 혈액 뇌 장벽 (BBB)은 혈액 대 뇌 접촉의 가장 큰 경계면이며 중추 신경계 (CNS) 1 , 2 의 항상성에 중심 역할을합니다. BBB의 동적 인 과정은 혈액에서 원하지 않는 분자의 섭취를 막고, CNS에서 폐기물을 제거하고, 필수 영양소와 신호 분자를 CNS에 공급하고, 신경 염증 1 , 2 , 3 , 4 , 5를 조절 합니다. BBB 손상은 노화 및 알쯔하이머 병 (AD), 다발성 경화증 및 뇌졸중 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,ass = "xref"> 6. 따라서 BBB 기능 장애는 치료 목표를 포함 해 신경 퇴행성 장애에 핵심적인 역할을 할 수 있습니다.
혈관 커버리지를 유지하는 것은 BBB의 항상성 기능에 중요합니다. 그러나, 생체 내 및 시험 관내 자료가 신경 퇴행성 장애에 관련된 과정이 AD에서 특히 BBB 적용 범위를 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13으로 증가시키는 지에 대해 충돌합니다. 따라서 BBB 범위의 역학을 평가하고보다 포괄적으로 이해하기 위해 관련 세포 유형을 사용 하는 시험 관내 모델의 개발에 대한 강력한 근거가 있습니다. 대뇌 모세 혈관은 성상 세포, 혈관 주위 세포 및 뇌 내피 세포 (BEC) <sup class = "xref"> 3. 모든 세포 유형은 paracrine 및 autocrine과 같은 방식으로 작용하는 혈관 형성 성장 인자, 사이토 카인 및 케모카인과 같은 효과기 분자의 구조적지지 및 분비를 통해 BBB의 기능에 기여합니다. 그러나, BBB의 주요 effector 세포는 BECs 3 입니다. 일반적으로 BBB 기능을 평가하기위한 세포 배양 기술은 스트레스 원 14 , 15 , 16 모두를 첨가 한 후 필터 삽입물에서 키운 세포에서 수행 된 투과성 분석 또는 주요 BEC 단백질의 수준 평가입니다. 중요한 것은이 검사는 뇌 혈관 검사에 초점을 두지 않는다는 것입니다.
여기에서 우리의 이전 방법 17 은 불멸화 된 인간 BEC의 단일 배양, 일차 마우스 BEC의 단일 배양 및 인간화 된 삼중 배양을 사용하여 BEC 적용 범위 및 망사 형 구조를 평가하기 위해 상세화된다모델 (BECs, astrocytes 및 pericytes) BBB. 목표는 BEC 적용 범위에서 AD 진행에 중요한 공헌자로 간주되는 oAβ의 해로운 영향을 입증하는 것이 었습니다. 표피 성장 인자 (EGF)의 보호 효과는 치료 선별 도구로서의 기술의 잠재력을 강조합니다. 이 기술은 1) 혈관 신생 및 혈관 범위에 대한 특정 경로의 역할을 묘사하는 것, 2) 혈관 신생 및 혈관 형성에 질병 및 노화 관련 요인의 영향을 평가하는 것, 3) 약리학 적 특성을 확인하는 것 목표.
Protocol
Representative Results
Discussion
기술 된 방법은 뇌 혈관 커버리지를 둘러싼 몇 가지 근본적인 생물학적 문제를 해결하기 위해 활용 될 수있다. 구체적으로, 그들은 수용체 및 신호 전달 경로가 혈관 신생, 암 조직에서의 혈관 확장 및 뇌와 관련된 말초 내피 세포에서 역할을하는지 확인할 수있다. 예를 들면, 혈관 신생 성장 인자 수용체, 산화 질소, 마이 토겐 활성화 단백질 키나아제 신호 전달 및 칼슘 신호 전달 25,26,27이 있습니…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
레온 타이 (Leon Tai)는 일리노이 대학 시카고 스타트 업 펀드가 자금을 지원합니다.
Materials
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
References
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