Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Summary

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia “vida andaimes”, exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Abstract

NEUROTRAUMA e neurodegenerativas doença muitas vezes resultam em duração déficits neurológicos devido à capacidade limitada do sistema nervoso central (SNC) a substituir neurônios perdidos e regeneração axonal caminhos. No entanto, durante o desenvolvimento do sistema nervoso, migração neuronal e axonal extensão ocorrem frequentemente ao longo dos caminhos formados por outras células, conhecido como “andaimes de viver”. Buscando para emular esses mecanismos e para a concepção de uma estratégia que contorna o ambiente inibitório do SNC, este manuscrito apresenta um protocolo para fabricar a engenharia de tecidos astrocyte-baseado “andaimes de viver”. Para criar essas construções, utilizamos um esquema de invólucro romance biomaterial para induzir astrócitos de auto-montagem em feixes tridimensionais densas de bipolar somata alinhado longitudinalmente e processos. Primeiro, oco hidrogel microcolunas foram montados, e o lúmen interno foi revestido com colágeno-matriz extracelular. Astrócitos corticais cerebrais dissociados então foram entregues no lúmen da microcoluna cilíndrica e, com um diâmetro interno crítico de < 350 µm, espontaneamente Self-alinhado e contratada para produzir cabos de fibra-like longas que consiste de feixes densos dos processos de astrocyte e fibrilas de colágeno medindo 97% de viabilidade celular e foram quase exclusivamente composta de astrócitos, expressando uma combinação de filamento intermediário proteínas glial fibrilar ácida proteína (GFAP), vimentina e nestin. Estas alinhadas astrocyte redes foram encontradas para fornecer um substrato permissivo para fixação neuronal e alinhado à extensão do axônio. Além disso, essas construções mantenham integridade e alinhamento quando extraído o invólucro de hidrogel, tornando-os adequados para implantação do CNS. Essas construções pré-formadas estruturalmente emulam chave cytoarchitectural elementos de ocorrência natural gliais com base em “vivendo andaimes” em vivo. Como tal, estes andaimes de vida projetada podem servir como teste-camas para estudar desenvolvimento neurológico mecanismos em vitro ou facilitar Epilepsias direcionando a migração neuronal e/ou axonal pathfinding degeneração CNS in vivo a seguir .

Introduction

Sistema nervoso central (SNC) tem uma capacidade limitada para compensar a perda e/ou disfunção dos neurônios e vias axonal que acompanham as condições tais como traumatismo crânio-encefálico (TCE), derrame, medular lesão (SCI) e neurodegenerativas doença^{1 ,2,3,4,5}. Neurogênese no SNC é restrito a um número limitado de áreas no cérebro, impedindo a restauração de neurônios perdidos^6,7. Além disso, a regeneração das vias axonal perdidas no SNC é insuficiente devido a falta de orientação dirigida, a presença de inibidores de consequência natural e astrogliosis reativa após danos ao tecido neural^{2,8, 9,10}. Astrócitos normalmente têm diversas funções na assistência neurônios com homeostase iónica, liberação de neurotransmissores, formação de sinapse e neurovasculares acoplamento¹¹. No entanto, seguindo até leve dano ao tecido neural, astrócitos podem sofrer mudanças moleculares, estruturais e funcionais como eles transição para um estado hipertrófica¹¹. Em resposta à severa neurotrauma, estas mudanças resultam na formação de uma cicatriz com uma penumbra contendo migrando astrócitos reativos e um núcleo de lesão que inclui leucócitos vazados da ruptura barreira hemato – encefálica (BBB), microglia, oligodendrócitos e fibroblastos^11,12,13. Estes astrócitos reativos atingir uma morfologia de processos filamentosos, desorganizados e exibem expressão aumentada de proteínas de filamento intermediário e proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs), que impedem a regeneração neural¹². Mesmo que a cicatriz glial inicialmente ajuda a restaurar a integridade BBB e evitar a transmissão da resposta inflamatória ao tecido saudável circundante, serve como uma barreira física e bioquímica contra axônio regeneração^{12,14 ,15,16}. Por exemplo, axônios que encontrar a cicatriz glial exibir cones de crescimento distrófica bulbosa e atrofiado crescimento¹². Além disso, a desorganização dos processos hamartomas após lesão impede a extensão de regeneração de axônios¹⁷. O resultado destas características inibitório manifesta-se nas deficiências permanentes muitas vezes físicas e neurológicas que os pacientes sofrem após grave neurotrauma, incluindo TBI e Sci.

Independentemente dos extrínsecos desafios funcional regeneração no SNC, axônios demonstraram possuir uma capacidade intrínseca de se regenerar. Por exemplo, a natureza dinâmica dos cones distrófica crescimento em contato com a cicatriz glial sugere que estes finais mantém sua capacidade de estender¹². Por conseguinte, acredita-se que um obstáculo principal para a re-crescimento axonal é o ambiente inibitório do CNS pós-lesão e que fornecendo um ambiente mais permissivo via redução de cicatrizes e/ou fornecendo regenerativas pontes sobre a cicatriz seria gliais vantajoso. De fato, estudos anteriores demonstraram que os neurônios do CNS eram capazes de estender axônios através de uma lesão utilizando enxertos de nervo periférico como pontes, que apresentam um ambiente mais favorável para o axônio regeneração^{12,18, 19}. Seguiram-se diversas outras estratégias para explorar essa capacidade regenerativa vestigial. Por exemplo, manipulação de vias de sinalização celular crescimento em vários modelos de lesão resultou na regeneração axonal e cicatriz glial redução^10,20,21. Além disso, estudos têm mostrado que o tratamento com chondroitinase ABC, que fende a maioria das cadeias de açúcar em CSPGs, diminui o efeito inibitório de CSPGs secretada por astrócitos reativos²². Apesar de encorajador resultados, essas abordagens não fornecem dirigido a orientação dos cones de crescimento, que pode potencialmente resultar em regeneração aberrante¹²e também não conta para a perda de neurônios. Abordagens baseadas em célula têm sido utilizadas em tentativas de ultrapassar os efeitos da cicatriz glial e para repor as células perdidas, particularmente os neurônios. Alguns grupos têm os astrócitos reativos em neurônios, enquanto outros transplantamos células progenitoras neurais em lesões de CNS para repovoar a área de lesão e promover o axônio regeneração^{23,24, 25}. no entanto, transplante de células-tronco sozinho é limitado por taxas de sobrevivência baixa integração pobre e modesta de retenção no tecido danificado⁵. Além disso, estas estratégias baseadas em células não restaurar a longa distância axonal panfletos, especialmente em uma maneira controlada. Portanto, biomateriais em combinação com outras abordagens estão sendo exploradas como veículos de entrega para vários neural e fatores de crescimento e células progenitoras²⁶. Abordagens baseadas em biomaterial apresentam um alto grau de controle de projeto para produzir construções que imitam o haptotaxic físico, específico, e sinais quimiotáxicas presente no microambiente (3D) tridimensional do destino anfitrião tecido^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reprodução desses sinais ambientais é de suma importância para células transplantadas apresentar morfologia como de um nativo, proliferação, migração e sinalização, entre outras características neurobiológicas²⁹. Apesar dessas propriedades vantajosas, avanço além da tradicional célula semeada biomaterial andaimes é necessário para substituir neurônios perdidos e promover a regeneração axonal longa distância dirigida simultaneamente.

Uma promissora abordagem alternativa baseia-se no tecido neural engenharia “andaimes vivos”, que são distintos de outras abordagens baseadas em célula devido à presença de células neurais vivas com um cytoarchitecture pré-formadas que emula neuroanatomia nativa e/ou mecanismos do desenvolvimento para facilitar a substituição do alvo, reconstrução e regeneração dos circuitos neurais^4,35. Considerações para o projeto de vida andaimes incluem os fenótipos e fontes de células neurais, bem como as propriedades mecânicas e/ou físicas e os sinais bioquímicos ditaram pela composição de qualquer acompanhamento de biomateriais³⁵. Após a fabricação em vitro, estes andaimes vivos podem ser implantado no vivo de moléculas de adesão celular presente e Quimiotáticos e neurotrophic sinaliza para regular ativamente a migração de células nervosas e consequência natural do axônio dependendo do estado e progressão dos processos regenerativos³⁵. Células gliais podem servir como base para a cytoarchitecture engenharia de andaimes de vida, desde que estas células mediam diversos mecanismos do desenvolvimento na vivo. Durante o desenvolvimento do cérebro, os neurônios novos dependem de processos basais prorrogados pela glia radial da zona ventricular para a placa de desenvolvimento cortical como andaimes vivos para migração dirigida^36,37. Além disso, estendendo o crescimento cones são mostrada para orientar-se por sensoriamento de sinais atraentes e repelentes eliciados células gliais guidepost, and so-called “pioneiro” axônios são sugeridos para alcançar as metas corretas, estendendo-se ao longo de pre-modelado gliais moldes de^38,35,39. Assim, as células gliais são necessárias para a orientação do pioneirismo de axônios, que mais tarde servem como baseado no axônio “andaimes de vida” para direcionar a projeção de axônios “seguidor”. Além disso, mecanismos de crescimento mediada por glia foram mostrados para persistir pós-natal, como neuroblastos seguem o fluxo migratório rostral (RMS) para navegar na zona subventricular (SVZ), uma das poucas áreas remanescentes da neurogênese no cérebro adulto, para o bulbo olfatório (OB)⁴⁰. Estes neuroblastos em RMS migram dentro do tubo glia (figura 1A-1), que é composto por processos hamartomas alinhados longitudinalmente, através de aderências direta célula-célula e localizadas fatores solúveis^{37, 41}. por fim, enquanto danos CNS em causas de mamíferos interrompeu arranjo hamartomas processo formando uma cicatriz glial que impede fisicamente a regeneração axonal¹⁷, muitos sistemas não-mamíferos faltam a formação de uma cicatriz glial prejudicial. Em vez disso, as células gliais de espécies não-mamíferos mantenham mais organizado, alinhados a padrões que são usados como guias através da região lesada^17,42,43. Por exemplo, em modelos de não-mamíferos SCI, axônios são mostrados para crescer em estreita associação com gliais pontes cruzando a lesão, sugerindo um papel importante para andaimes gliais organizados como substratos, facilitando a regeneração axonal e recuperação funcional ( Figura 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. recapitulação das características neuroanatômica e os mecanismos do desenvolvimento/regenerativa descritos acima pode produzir uma nova classe de engenharia baseada em gliais vivos andaimes que simultaneamente pode conduzir a migração neuronal imatura e axonal Pathfinding através de ambientes caso contrário não-permissivo, assim, potencialmente, mitigação dos efeitos da neuronal e degeneração do trato de axônio associado com lesão do CNS e doença.

Nosso grupo de pesquisa anteriormente desenvolveu vários tipos de andaimes de vida para a reconstrução e regeneração dos tracts axonal no SNC e o sistema nervoso periférico (SNP) através de microtecido projetado redes neurais (micro-TNS) e tecido enxertos de nervo engenharia (TENGs), respectivamente,^27,46,,^47,48. Ambas as estratégias são inerentemente baseia biomimetismo. Micro-TNS são estruturas anatomicamente inspirada projetadas estruturalmente e funcionalmente substituir axonal folhetos conectando distintas populações neuronais do cérebro. TENGs explorar o mecanismo de desenvolvimento da regeneração axonal axônio-facilitada, exemplificado pelo crescimento do axônio “seguidor” ao longo de axônios “pioneiro”, para alcançar o hospedeiro alvo regeneração axonal^35,46,48. Nós recentemente capitalizou a versatilidade do andaime a vida técnica usando um esquema similar do encastoamento como micro-TNS e buscando inspiração os mecanismos baseados em glia de presentes durante todo o desenvolvimento. Aqui, nós desenvolvemos construções consistindo de feixes hamartomas alinhados, abrangendo o lúmen colágenas de um hidrogel microcoluna⁴⁹. Estes andaimes hamartomas vivos são desenvolvidos pelo primeiro preencher um conjunto de agulha de acupuntura-tubo capilar com líquido agarose para criar um hidrogel cilíndrico oco com um diâmetro externo (OD) e o diâmetro interno (ID) correspondente para os diâmetros do tubo e agulha, respectivamente. Na sequência de gelificação de agarose e extração de hidrogel microcoluna do tubo capilar, o interior oco é revestido com tipo eu colágeno para fornecer um ambiente permissivo para a adesão de astrocyte e alinhado à formação de feixe (figura 1B -1). Depois, o lúmen é semeado com astrócitos corticais cerebrais, isolados de filhotes pós-natal (figura 1B-2). Contrariamente ao bidimensional (2D) alinhamento as técnicas que dependem da aplicação de campos elétricos, micropatterned grooves e matriz extracelular da proteína (ECM), padronização, alinhamento astrocyte no cadafalso vivos técnica depende de auto-montagem de acordo com variáveis controláveis como colágeno concentração^50,,^51,52, densidade celular e curvatura do substrato (coluna ID). Os astrócitos contraem e remodelam o colágeno e adquirem uma morfologia bipolar, alinhado longitudinalmente análoga para os andaimes naturais observados na vivo (figura 1B-3). Com efeito, estamos ativamente perseguindo o uso destas estruturas de cabo, como como substratos físicos para orientação alvo da migração de neurônios imaturos, bem como facilitar a regeneração axonal através do ambiente desfavorável do SNC danificado, particularmente a cicatriz glial mamíferos (Figura 1). Este artigo irá apresentar o método de fabricação detalhada para as microcolunas hamartomas, contraste e imunofluorescência imagens de cytoarchitecture o esperado e uma discussão abrangente sobre as limitações atuais e futuras direções da fase a técnica.

Figura 1: inspiração, protocolo de fabricação e aplicações propostas para as redes de hamartomas alinhadas. (A) neurobiológicos inspiração: neuroblastos (1), originários da zona subventricular neurogênica (SVZ) utilizam o tubo glia alinhado longitudinalmente do fluxo migratório rostral (RMS) para migração dirigida para o bulbo olfatório (OB); (2) não-mamíferos, como os anfíbios e peixes podem sustentar a regeneração após dano no tecido neural em parte devido à formação de uma ponte glia que conecta as extremidades de uma lesão (por exemplo, medula espinhal necrosante) e serve como um andaime para a orientação de regeneração de axônios. (B) visão geral de fabricação: (1) a construção de uma hidrogel de micro-empresas, oco microcoluna com o lúmen revestido com ECM, (2) semeadura do primários astrócitos corticais isolados de filhotes pós-natal, (3) auto-montagem do longitudinalmente orientada pacotes em cultura e (4) extraído do pacote o invólucro de biomaterial para estudos futuros de implantação. (C) na vivo aplicações: (1) estes andaimes de vida podem servir como tubos gliais projetados para a migração de neurônio dirigido de centros neurogênicos repovoar regiões do neurônio-deficiente; (2) recapitulação o mecanismo do desenvolvimento de pioneirismo orientação do axônio e o mecanismo regenerativo das pontes gliais de não-mamíferos pode dotar estes andaimes hamartomas com a capacidade de direcionar a regeneração do axônio através do não-permissivo ambiente da cicatriz glial mamífera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso de comissões na Universidade da Pensilvânia e o Michael J. Crescenz veteranos assuntos Medical Center e aderiu às diretrizes estabelecidas na política de serviço de saúde pública de NIH em humanos Cuidado e uso de animais de laboratório (2015). 1. desenvolvimento de Agarose Hydrogel Microcolunas Fazer uma solução de peso/volume (p/v) de 3% de agarose pesando 3 g de agarose e transferindo-o par…

Representative Results

Inicialmente, contraste de fase microscopia foi usada para monitorar a progressão da formação de aderência e pacote de astrocyte e a estabilidade geral da cytoarchitecture como uma função do tempo. A 1 h depois de chapeamento, astrócitos foram encontrados ao longo do lúmen das microcolunas com uma morfologia esférica (Figura 2A). Às 5h, astrócitos começaram a estender processos e contraindo, enquanto h 8 células exibiram uma morfologia de process…

Discussion

Quando comparado com o ambiente mais favorável do PNS, o CNS é particularmente limitado em lidar com as consequências prejudiciais de neurotrauma e neurodegeneração. Após um grave insulto ao SNC mamífero, é formada uma cicatriz glial, consistindo de um núcleo de células inflamatórias e fibróticos rodeado por uma densa malha de astrócitos reativos desorganizadas que secretam proteoglicanos inibindo a consequência natural do axônio¹⁴. Esta cicatriz atua como uma obstrução física e …

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30×40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).