Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Summary

Wir präsentieren die Entwicklung des selbst-zusammengebauten, dreidimensionale Bündel longitudinal ausgerichteten astrocytic Somata und Prozesse innerhalb ein neuartiges Biomaterial-Ummantelung. Diese “lebende Gerüste”, präsentiert Mikron-Skala Durchmesser noch Zentimeter in der Länge, Verlängerung dienen als Testumgebungen zu Entwicklungsstörungen Mechanismen zu studieren oder zu erleichtern Neuroregeneration Regie neuronalen Migration und/oder axonalen entwickelt Pathfinding.

Abstract

Neurotrauma und neurodegenerativen Krankheiten führen oft bleibende neurologische Ausfälle aufgrund der begrenzten Kapazität des zentralen Nervensystems (ZNS) zu ersetzen verlorene Neuronen und axonalen Wege zu regenerieren. Jedoch treten während der Entwicklung des Nervensystems, neuronale Migration und axonalen Erweiterung oft entlang von wegen, die von anderen Zellen gebildet, als “lebende Gerüste” bezeichnet. Bestrebt, diese Mechanismen zu emulieren und eine Strategie zu entwerfen, die die hemmende Umwelt des ZNS umgeht, dieses Manuskript stellt ein Protokoll zu fertigen Gewebezüchtungen Astrozyten-basierte “lebenden Gerüste”. Um diese Konstrukte zu erstellen, haben wir ein neuartiges Biomaterial Encasement Schema induzieren Astrozyten, in dichten dreidimensionalen Bündel von bipolaren längs ausgerichtet Somata und Prozessen selbst zusammensetzen beschäftigt. Erste, hohlen Hydrogel Mikro-Spalten wurden zusammengestellt, und im Inneren Lumen mit extrazellulären Kollagen-Matrix beschichtet wurde. Dissoziierte zerebrale kortikale Astrozyten lieferten dann in das Lumen der zylindrischen Mikro-Spalte und mit einem kritischen inneren Durchmesser von < 350 µm, spontan selbst ausgerichtet und beauftragt, lange Faser-wie Kabel bestehend aus dichten Bündel produzieren Astrozyten Prozesse und Kollagen-Fibrillen Messung 97 % Zelle Lebensfähigkeit und wurden fast ausschließlich bestehend aus Astrozyten eine Kombination des intermediate Filament Proteine glial fibrillary sauren Proteins (GFAP), Vimentin, zum Ausdruck zu bringen und nestin. Diese ausgerichtet Astrozyten Netzwerke für neuronalen Anlage zu einem freizügigen Substrat gefunden wurden und Neurit Erweiterung ausgerichtet. Darüber hinaus erhalten diese Konstrukte Integrität und Ausrichtung, wenn die Hydrogel-Ummantelung, eignen sich für die CNS Implantation entnommen. Diese vorgeformten Konstrukte emulieren strukturell wichtigsten Cytoarchitectural Elemente des natürlich vorkommenden Glia-basierte “living Gerüste” in Vivo. Als solche können diese veränderter lebenden Gerüste dienen als Testumgebungen zu Entwicklungsstörungen Mechanismen in Vitro zu studieren oder zu erleichtern Neuroregeneration durch die Leitung der neuronalen Migration und/oder axonalen Wegfindung nach CNS Degeneration in-vivo .

Introduction

Das zentrale Nervensystem (ZNS) hat eine begrenzte Kapazität gegen Verlust und/oder Funktionsstörungen der Nervenzellen und axonalen Signalwege, die Bedingungen wie Schädel-Hirn-Verletzungen (SHT), begleiten Schlaganfall, Rückenmark Verletzungen (SCI) und Neurodegenerative Krankheit^{1 ,2,3,4,5}. Neurogenese im ZNS beschränkt sich auf eine begrenzte Anzahl von Bereichen im Gehirn behindern die Wiederherstellung der verlorenen Neuronen^6,7. Darüber hinaus ist Regeneration der verlorenen axonalen Wege im ZNS nicht ausreichend durch das Fehlen einer gezielten Führung, das Vorhandensein von Auswuchs Inhibitoren und reaktive Astrogliosis nach Schäden an Nervengewebe^{2,8, 9,10}. Astrozyten haben in der Regel diverse Funktionen bei der Unterstützung der Neuronen mit Ionen-Homöostase, Neurotransmitter-Clearance, Synapse Bildung und neurovaskuläre Kopplung¹¹. Dennoch können Astrozyten nach auch leichte Schäden an Nervengewebe, molekulare, strukturelle und funktionelle Veränderungen unterziehen, um eine hypertrophe staatliche¹¹Übergang. Als Reaktion auf schwere Neurotrauma führen diese Veränderungen bei der Bildung einer Narbe mit einer Penumbra, Migration von reaktiven Astrozyten und eine Läsion Kern, der Leukozyten von der geplatzten Blut – Hirn-Schranke (BBB), Mikroglia durchgesickert enthält enthält, Oligodendrozyten und Fibroblasten^11,12,13. Diese reaktive Astrocyten erreichen eine Morphologie des faserigen, ungeordnete Prozesse und zeigen erhöhte Expression von intermediate Filament Proteine und Chondroitinsulfat Proteoglycans (CSPGs), die neurale Regeneration¹²behindern. Obwohl die glial Narbe anfangs hilft BBB Integrität wiederherzustellen und Übertragung der Entzündungsreaktion umliegenden gesunden Gewebes zu vermeiden, dient es als biochemische und physikalische Barriere gegen Axon Regeneration^{12,14 ,15,16}. Zum Beispiel Axone, die Begegnung die glial Narbe bauchige dystrophischen Wachstum Kegel anzeigen und verkümmert Wachstum¹². Darüber hinaus behindert die Desorganisation der astrocytic Prozesse nach einer Verletzung die Verlängerung der regenerierende Axone¹⁷. Das Ergebnis dieser hemmenden Eigenschaften manifestiert sich in der oft dauerhafte körperlichen und neurologischen Beeinträchtigungen, die Patienten nach schweren Neurotrauma leiden, einschließlich TBI und Sci.

Unabhängig von der äußeren Herausforderungen funktionelle Regeneration im ZNS nachweislich die Axone besitzen eine intrinsische Fähigkeit zu regenerieren. Zum Beispiel zufolge die dynamische Natur der dystrophischen Wachstum Kegel in Kontakt mit der glial Narbe diese Endungen behalten ihre Fähigkeit,¹²zu erweitern. Infolgedessen wird es vermutet, dass als wichtigste Hindernis für axonalen Nachwachsen der hemmenden Umwelt der posttraumatischen CNS und Bereitstellung einer großzügigeren Umgebung über Reduktion glialen Narbenbildung und/oder sofern regenerative Brücken über die Narbe wäre vorteilhaft. In der Tat haben Studien gezeigt, dass ZNS-Neuronen waren in der Lage, die Ausweitung der Axone durch eine Läsion mit peripheren Nerv Transplantationen als Brücken, die ein günstigeres Umfeld für Axon Regeneration^{12,18zu präsentieren, 19}. Mehrere andere Strategien haben verfolgt, um diese verkümmerte Regenerationsfähigkeit zu nutzen. Manipulation der Zelle Wachstum Signalwege in verschiedenen Verletzungen resultieren beispielsweise axonalen Regeneration und glial Narbe Reduktion^10,20,21. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die Behandlung mit Chrondroitinase ABC, die den Großteil der Zuckerketten in CSPGs zerspaltet, die hemmende Wirkung von CSPGs abgesondert durch reaktive Astrocyten²²verringert. Trotz ermutigender Ergebnisse, diese Ansätze bieten keine Führung des Wachstums Zapfen, gerichtet, die potenziell aberrierende Regeneration¹²führen kann, und auch nicht für den Verlust von Neuronen zu berücksichtigen. Zell-basierte Ansätze wurden genutzt, bei versuchen, die Auswirkungen der glial Narbe zu überwinden und um verlorene Zellen, vor allem Neuronen wieder aufzufüllen. Einige Gruppen haben entdifferenzierten reaktive Astrocyten in Neuronen, während andere neurale Vorläuferzellen in CNS Läsionen zum repopulate Bereich Verletzungen und zur Förderung Axon Regeneration^23,24, , verpflanzt haben ²⁵. Stammzelltransplantation allein ist jedoch durch die niedrigen Überlebensraten, mangelhafte Integration und bescheidenen Retention in das geschädigte Gewebe⁵begrenzt. Darüber hinaus nicht diese Zell-basierte Strategien Fernverkehr axonalen Landstriche, vor allem in einer kontrollierten Weise wiederherzustellen. Daher als Lieferfahrzeuge für verschiedene neuronale Biomaterialien in Kombination mit anderen Ansätzen erforscht und Vorläuferzellen und Wachstum Faktoren²⁶. Biomaterial-basierte Ansätze verfügen über ein hohes Maß an Design-Steuerung, Konstrukte zu produzieren, die die spezifischen körperlichen, Haptotaxic zu imitieren, und chemotaxic Hinweise in der dreidimensionalen (3D) Mikroumgebung der Ziel-Host Gewebe^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproduktion von diesen Umweltsignale ist von größter Bedeutung für die transplantierten Zellen, Native-ähnliche Morphologie, Proliferation, Migration und Signaltechnik, unter anderen neurobiologischen Eigenschaften²⁹zu präsentieren. Trotz dieser vorteilhaften Eigenschaften ist Fortschritt jenseits traditioneller Zelle ausgesät Biomaterial Gerüste erforderlich, um gleichzeitig Regie Fernverkehr axonalen Regeneration fördern und ersetzen verlorene Neuronen.

Eine vielversprechende alternative Ansatz basiert auf Nervengewebe entwickelt “lebenden Gerüste”, unterscheidet sich von anderen Zell-basierte Ansätze aufgrund des Vorhandenseins von lebenden Nervenzellen mit einem vorgeformten Cytoarchitecture, die native Neuroanatomie emuliert und/oder Entwicklungsmechanismen gezielte Ersatz, Wiederaufbau und Regenerierung der neuralen Schaltkreis^4,35zu erleichtern. Überlegungen für die Gestaltung von lebendigen Gerüste gehören die Phänotypen und Quellen von neuronalen Zellen sowie die mechanische/physikalische Eigenschaften und die biochemische Signale durch die Zusammensetzung der begleitenden Biomaterialien³⁵diktiert. Nach Fertigung in Vitro, diese lebenden Gerüste können implantiert in Vivo vorhanden Zelle Adhäsionsmoleküle und chemotaktische und neurotrophe Signale zum neuronalen Zellwanderung und Axon Auswuchs je nach Zustand aktiv regulieren und Fortschreiten der regenerativen Prozesse³⁵. Gliazellen dienen als Grundlage für die veränderter Cytoarchitecture lebenden Gerüste, da diese Zellen verschiedene Entwicklungsmechanismen in Vivozu vermitteln. Während der Entwicklung des Gehirns setzen neue Neuronen auf basalen Prozesse durch radiale Gliazellen aus der ventrikulären Zone in Richtung der Entwicklung kortikale Platte als lebende Gerüste für gerichtete Migration^36,37erweitert. Darüber hinaus erweitern Wachstum sind Zapfen gezeigt, sich zu orientieren, durch Sensierung attraktiv und abweisend Signale ausgelöst durch Wegweiser Glia-Zellen, und sogenannte “Pionierarbeit” Axone werden vorgeschlagen, um die richtigen Ziele zu erreichen, durch die Ausdehnung entlang Pre-gemusterten Glia ^35,38,39Gerüste. Gliazellen sind also notwendig, um die Führung des bahnbrechenden Axone, die später als Axon-basierte dienen “lebenden Gerüste” um die Projektion der “Mitläufer” Axone leiten. Darüber hinaus Glia-vermittelten Wachstum Mechanismen haben gezeigt, dass postnatal, fortbestehen folgendermaßen Neuroblasten rostral wandernden Stream (RMS), aus der subventricular Zone (SVZ), einer der wenigen verbliebenen Bereiche der Neurogenese im erwachsenen Gehirn zu navigieren die Riechkolben (OB)⁴⁰. Diese Neuroblasten in der RMS migrieren innerhalb der Glia Röhre (Abbildung 1A-1), die besteht aus längs ausgerichteten astrocytic Prozesse, über direkten Zell-Zell-Verwachsungen und lokalisiert lösliche Faktoren^{37, 41}. schließlich während CNS Schäden in Säugetieren Ursachen astrocytic Prozess Anordnung bilden eine glial Narbe, die körperlich axonale Regeneration^{17 gestört behindert}, viele nicht-Säugetier-Systemen fehlt die Bildung einer nachteiligen glial Narbe. Vielmehr pflegen Gliazellen des nicht-Säugetier-Arten mehr organisiert, ausgerichtet von Mustern, die als Führer durch die verletzte Region^17,42,43verwendet werden. Zum Beispiel nicht-Säugetier-SCI-Modelle, Axone entnehmen Sie bitte weiter in enger Zusammenarbeit mit Glia Brücken über der Läsion, schlägt eine wichtige Rolle für organisierte Glia Gerüste als Erleichterung der axonalen Regeneration und funktionelle Wiederherstellung (Substrate Abbildung 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. Reprise der neuroanatomischen Eigenschaften und die Entwicklungs-/regenerative Mechanismen, die oben beschriebenen kann dies zu eine neue Klasse von veränderter Glia-basierte lebenden Gerüste, die unreif neuronalen Migration gleichzeitig fahren können und axonalen Wegfindung durch ansonsten freizügigen Umgebungen, damit potenziell Minderung der Auswirkungen von neuronalen und Axon Trakt Degeneration mit CNS Verletzung und Krankheit verbunden.

Unsere Forschungsgruppe hat bereits mehrere Arten von lebenden Gerüste für den Wiederaufbau entworfen und Regeneration der axonalen Traktate in das ZNS und das periphere Nervensystem (PNS) über Micro-Gewebe entwickelt, neuronale Netze (Mikro-TENNs) und Gewebe Nerv Transplantationen (TENGs) bzw.^27,46,47,48entwickelt. Beide Strategien basieren grundsätzlich auf Biomimicry. Mikro-TENNs sind anatomisch inspirierte Strukturen strukturell und funktionell axonalen Traktate verbinden unterschiedliche neuronale Populationen des Gehirns ersetzen soll. TENGs ausnutzen den Entwicklungsbiologie Mechanismus der Axon erleichtert axonalen Regeneration, veranschaulicht durch “Mitläufer” Axon Wachstum entlang “Pionier” Axone, gezielte Host axonalen Regeneration^35,46,48zu erreichen. Wir vor kurzem auf die Vielseitigkeit des Gerüstes lebenden aktiviert Technik mit einem ähnlichen Schema Ummantelung als Mikro-TENNs und inspirieren von den Glia-basierte Mechanismen zu präsentieren, während der gesamten Entwicklung. Hier haben wir Konstrukte bestehend aus ausgerichteten astrocytic Bündel überspannt das kollagene Lumen ein Hydrogel Mikro-Spalte⁴⁹entwickelt. Diese astrocytic lebenden Gerüste werden von ersten füllen eine Kapillare Rohr-Akupunktur Nadel Montage mit flüssige Agarose Erstellen einer hohlen zylindrischen Hydrogel mit einem Außendurchmesser (OD) und Innendurchmesser (ID) entspricht der Durchmesser der entwickelt die Schlauch und Nadel, beziehungsweise. Nach Agarose Gelierung und Extraktion der Hydrogel Mikro-Spalte aus der Kapillare, die innen hohl ist beschichtet mit Typ ich Kollagen, ein Umfeld für Astrozyten Adhäsion permissive liefern und ausgerichtet Bundle Bildung (Abbildung 1 b -1). Danach ist das Lumen mit zerebrale kortikale Astrozyten isoliert vom postnatalen Ratte Welpen (Abbildung 1 b-2) ausgesät. Im Gegensatz zu zweidimensionalen (2D) Ausrichtung Techniken, die auf die Anwendung von elektrischen Feldern, Micropatterned Rillen und extrazelluläre Matrix (ECM) Protein-Strukturierung, Astrozyten Ausrichtung in die lebendige Gerüst stützt sich Technik auf Selbstmontage nach steuerbare Variablen wie Substrat Krümmung (Spalte ID), Zelldichte und Kollagen Konzentration^50,51,52. Die Astrozyten Vertrag umzugestalten das Kollagen und erwerben eine bipolare, längs ausgerichtet Morphologie, die analog zu den natürlichen Gerüste in Vivo (Abbildung 1 b-3) beobachtet. In der Tat verfolgen wir aktiv den Einsatz dieser Kabel-ähnliche Strukturen als physische Substrate für gezielte Führung des Migration unreifer Nervenzellen sowie Erleichterung der axonalen Regeneration durch die ungünstigen Umfeld des beschädigten ZNS, insbesondere die Säugetier-glial Narbe (Abbildung 1). Dieser Artikel wird die detaillierte Herstellungsverfahren für die astrocytic Mikro-Spalten präsentieren, phase Kontrast und Immunfluoreszenz Bilder von der erwarteten Cytoarchitecture und eine umfassende Diskussion über die aktuellen Beschränkungen und zukünftige Richtungen von der Technik.

Abbildung 1: Inspiration, Herstellung Protokoll und vorgeschlagenen Anwendungen für die ausgerichteten Astrocytic Netzwerke. (A) neurobiologische Inspiration: (1) Neuroblasten aus der neurogenen subventricular Zone (SVZ) nutzen das längs ausgerichtete Glia Rohr in den rostral wandernden Stream (RMS) für gerichtete Migration in den Riechkolben (OB); (2) nicht-Säugetiere wie Amphibien und Fischen verträgt Regeneration nach Nervengewebe Schäden teilweise durch die Bildung einer Glia Brücke, die verbindet die Enden einer Läsion (z.B. durchtrennten Rückenmark) und dient als Gerüst für die Führung des regenerierende Axone. (B) Herstellung Übersicht: (1) Bau einer Mikrometer Größe, hohlen Hydrogel Mikro-Spalte mit dem Lumen mit ECM, beschichtet (2) Aussaat von primären kortikalen Astrozyten isoliert vom postnatalen Ratte Welpen (3) Selbstmontage der längs-orientierte Bündel in Kultur und (4) Extraktion des Bundles aus Biomaterial-Ummantelung für zukünftige Implantation Studien. (C) In Vivo Anwendungen: (1) diese lebenden Gerüste können dienen als veränderter Glia Rohre für gerichtete Neuron Migration von neurogenen Zentren Neuron-defizienten Regionen; neu aufzufüllen (2) Reprise des developmental Mechanismus von zukunftsweisenden Axon Guidance und der regenerativen Mechanismus der Glia Brücken in nicht-Säugetiere kann diese astrocytic Gerüste mit einer Kapazität von Axon Regeneration über die non-permissive direkte verleihen. Umgebung der Säugetier-glial Narbe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

Alle Verfahren wurden durch die institutionelle Animal Care and Verwendung Ausschüsse an der University of Pennsylvania und Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center genehmigt und den Vorgaben in der NIH Public Health Servicepolitik auf Humane eingehalten Pflege und Verwendung von Labortieren (2015). 1. Entwicklung der Agarose Hydrogel Micro-Spalten Machen Sie eine Agarose 3 % Gewicht/Volumen (w/V) Lösung durch Wiegen 3 g Agarose und Übertragung auf eine sterile Becher m…

Representative Results

Zunächst Phasenkontrast-Mikroskopie wurde verwendet, um das Fortschreiten der Astrozyten Adhäsion und Bundle-Bildung und die Gesamtstabilität der Cytoarchitecture als Funktion der Zeit zu überwachen. 1 h nach der Beschichtung fanden sich Astrozyten in das Lumen der Mikro-Spalten mit einer sphärischen Morphologie (Abbildung 2A). Um 5 Uhr Astrozyten begann Prozesse erweitern und zusammenziehen, während von 8 h Zellen stellte eine komplette Prozess-Lager-M…

Discussion

Im Vergleich zu mehr unterstützendes Umfeld der PNS beschränkt die CNS besonders im Umgang mit den nachteiligen Folgen der Neurotrauma und Neurodegeneration. Nach eine schwere Beleidigung der Säugetier-CNS wird eine glial Narbe gebildet, bestehend aus einem Kern von fibrotischen und entzündlichen Zellen umgeben von einem dichten Geflecht unorganisiert reaktive Astrocyten, die Axon Auswuchs hemmende Proteoglycans¹⁴absondern. Diese Narbe wirkt wie ein physischer und biochemischer Hindernis gegen…

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30×40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).