Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Summary

Presenteremo lo sviluppo di auto-assemblati, tridimensionale fasci di somata astrocytic allineati longitudinalmente e processi all’interno di un encasement romanzo biomateriale. Questi ingegnerizzato “ponteggi vivente”, che esibiscono micron-scala diametro ancora estendere centimetri di lunghezza, può servire come banchi di prova per lo studio dei meccanismi dello sviluppo neurologico o facilitare la neurorigenerazione di regia della migrazione neuronale e/o assonale path-finding.

Abstract

Malattia di neurodegenerative e neurotrauma provocare spesso durevole deficit neurologici a causa della limitata capacità del sistema nervoso centrale (CNS) per sostituire i neuroni persi e rigenerare le vie axonal. Tuttavia, durante lo sviluppo del sistema nervoso, della migrazione neuronale ed assonale estensione spesso si verificano lungo le vie formate da altre cellule, indicato come “vita ponteggi”. Cercando di emulare questi meccanismi e per progettare una strategia che elude l’ambiente inibitorio del SNC, questo manoscritto presenta un protocollo per fabbricare tessuti ingegnerizzati basati su astrociti “vivente ponteggi”. Per creare questi costrutti, abbiamo impiegato uno schema di encasement del romanzo biomateriale per indurre gli astrociti di auto-assemblarsi in tridimensionale densi fasci di bipolare somata allineati longitudinalmente e processi. Idrogel in primo luogo, cavo micro-colonne erano riunite, e il lume interno è stato rivestito con collagene-matrice extracellulare. Astrocytes corticali cerebrali dissociato quindi sono state consegnate nel lumen della micro-colonna cilindrica e, a un diametro interno critico di < 350 µm, spontaneamente auto-allineati e contratta per produrre fibra come lunghi cavi composto densi fasci dei processi di astrociti e fibrille di collagene misura 97% vitalità cellulare e sono stati quasi esclusivamente composta da astrociti esprimendo una combinazione del filamento intermedio proteine glial-proteina silicea fibrillare (GFAP), vimentina e nestina. Questi stati allineati Astrocita reti sono state trovate per fornire un substrato permissivo per il fissaggio di un neurone e allineato del neurite estensione. Inoltre, questi costrutti mantengono l’integrità e l’allineamento quando estratti dal encasement di idrogel, che li rende adatti per l’impianto di CNS. Questi costrutti preformati strutturalmente emulano gli elementi chiave cytoarchitectural di biofiltri glial-based “vivere impalcature” in vivo. Come tale, queste impalcature derivati dal vivente possono servire come banchi di prova per studiare neurodevelopmental meccanismi in vitro o facilitare la neurorigenerazione dirigendo la migrazione neuronale e/o pathfinding axonal seguendo la degenerazione di CNS in vivo .

Introduction

Il sistema nervoso centrale (SNC) ha una capacità limitata per contrastare la perdita e/o disfunzione dei neuroni e vie axonal che accompagnano condizioni come la ferita di cervello traumatica (TBI), ictus, malattia di ferita (SCI) e neurodegenerative del midollo spinale^{1 ,2,3,4,5}. Neurogenesi nel SNC è limitata a un numero limitato di aree del cervello, che ostacolano il restauro di neuroni persi^6,7. Inoltre, la rigenerazione delle vie axonal perse nello SNC è insufficiente a causa della mancanza di orientamento diretto, la presenza di inibitori di conseguenza e astrogliosi reattiva dopo danno di tessuto neurale^{2,8, 9,10}. Astrociti in genere hanno diverse funzioni nell’assistere i neuroni con omeostasi ionica, neurotrasmettitore gioco, formazione della sinapsi e neurovascular attacco¹¹. Tuttavia, in seguito anche lievi danni al tessuto neurale, astrocytes possono subire variazioni molecolari, strutturali e funzionali come la transizione a un stato ipertrofico¹¹. In risposta a grave neurotrauma, questi cambiamenti provocano la formazione di una cicatrice con una penombra contenente la migrazione astrociti reattivi e un nucleo di lesione che include leucociti trapelati dalla rottura emato – encefalica (BBB), microglia, oligodendrociti e fibroblasti^11,12,13. Questi astrociti reattivi raggiungono una morfologia dei processi filamentosi, disorganizzati ed esibiscono l’espressione aumentata di proteine dei filamenti intermedi e proteoglicani Condroitin solfato (CSPG), che ostacolano la rigenerazione neurale¹². Anche se inizialmente la cicatrice gliale aiuta a ripristinare l’integrità BBB ed evitare la trasmissione della risposta infiammatoria al tessuto sano circostante, serve come una barriera fisica e biochimica contro assone rigenerazione^{12,14 ,15,16}. Per esempio, gli assoni che incontrano la cicatrice gliale visualizzare dei coni di crescita distrofica bulboso e stentata crescita¹². Inoltre, la disorganizzazione dei processi astrocitari dopo lesione impedisce l’estensione della rigenerazione di assoni¹⁷. Il risultato di queste caratteristiche inibitorie si manifesta spesso permanenti menomazioni fisiche e neurologiche che pazienti soffrono dopo neurotrauma grave, tra cui TBI e SCI.

Indipendentemente dalle sfide estrinseche funzionale rigenerazione nel SNC, assoni hanno dimostrati di possedere un’intrinseca capacità di rigenerarsi. Per esempio, la natura dinamica dei coni di crescita distrofico a contatto con la cicatrice gliale suggerisce che queste terminazioni mantengono la loro capacità di estendere¹². Di conseguenza, si ritiene che un ostacolo principale alla ricrescita assonale è l’ambiente inibitorio del SNC di alberino-ferito e che fornendo un ambiente più permissivo via la riduzione di cicatrici e/o fornendo rigenerative ponti attraverso la cicatrice sarebbe glial vantaggioso. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che i neuroni CNS erano capaci di estendere gli assoni attraverso una lesione usando gli innesti di nervi periferici come ponti, che presentano un ambiente più favorevole per assone rigenerazione^{12,18, 19}. Parecchie altre strategie sono state perseguite per sfruttare questa capacità rigenerativa vestigiale. Ad esempio, manipolazione delle vie di segnalazione cellulare crescita in vari modelli di lesione ha provocato la rigenerazione assonale e cicatrice gliale riduzione^10,20,21. Inoltre, gli studi hanno indicato che il trattamento con chondroitinase ABC, che scinde la maggior parte delle catene dello zucchero in CSPG, diminuisce l’effetto inibitorio di CSPG secernuto da astrociti reattivi²². Nonostante incoraggianti i risultati, questi approcci non forniscono diretto orientamento dei coni di crescita, che può potenzialmente causare rigenerazione aberrante¹²e inoltre non tengono conto della perdita di neuroni. Approcci basati su cellule sono stati utilizzati nei tentativi per superare gli effetti della cicatrice gliale e per ricostituire le cellule perse, in particolare i neuroni. Alcuni gruppi hanno dedifferenziate di astrociti reattivi nei neuroni, mentre gli altri sono trapiantate cellule progenitrici neurali in lesioni dello SNC di ripopolare la zona ferita e promuovere assone rigenerazione^{23,24, 25}. Tuttavia, trapianto di cellule staminali è limitato dalla bassa sopravvivenza, scarsa integrazione e conservazione modesta nel tessuto danneggiato⁵. Inoltre, queste strategie basate sulle cellule non riescono a ripristinare a distanza axonal tratti, soprattutto in un modo controllato. Di conseguenza, biomateriali in combinazione con altri approcci stanno esplorande come veicoli di consegna per vari neurale e fattori di crescita e cellule progenitrici²⁶. Approcci basati su biomateriali presentano un elevato grado di controllo di progettazione per la produzione di costrutti che imitano le specifiche fisiche, haptotaxic, e chemotaxic spunti presentano nel microambiente tridimensionale (3D) di destinazione host tessuto^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Riproduzione di questi segnali ambientali è preminente per cellule trapiantate a presentare nativo-come la morfologia, la proliferazione, migrazione e segnalazione, tra le altre caratteristiche neurobiologiche²⁹. Nonostante queste proprietà vantaggiose, avanzamento oltre tradizionale delle cellule seminate biomateriale ponteggi è necessaria per promuovere la rigenerazione assonale interurbano diretta e sostituire i neuroni persi contemporaneamente.

Un promettente approccio alternativo si basa su tessuto neurale ingegnerizzato “ponteggi vivente”, che sono distinti da altri approcci basati su cellule a causa della presenza di cellule neurali viventi con un cytoarchitecture preformato che emula neuroanatomia nativo e/o meccanismi per facilitare la sostituzione mirata, la ricostruzione e la rinascita di circuiti neurali^4,35. Considerazioni per la progettazione di ponteggi viventi includono i fenotipi e le fonti di cellule neurali, come pure le proprietà fisiche e meccaniche e i segnali biochimici dettata dalla composizione di qualsiasi accompagnamento di biomateriali³⁵. Dopo il montaggio in vitro, queste impalcature vivente possono essere impiantato in vivo di molecole di adesione cellulare presente e chemiotattica e neurotrophic segnali per regolare attivamente la migrazione delle cellule neurali e crescita assonale a seconda dello stato e progressione dei processi rigenerativi³⁵. Le cellule gliali possono servire come base per i derivati dal cytoarchitecture di vita ponteggi poiché queste cellule mediano vari meccanismi in vivo. Durante lo sviluppo cerebrale, nuovi neuroni si basano su processi basali esteso da glia radiale dalla zona ventricolare verso la piastra corticale in via di sviluppo come vivente impalcature per migrazione diretto^36,37. Inoltre, estendendo la crescita coni sono mostrato a orientarsi rilevando segnali attraenti e repellenti suscitati dalle cellule gliali guidepost e cosiddetto “pionieristico” assoni sono consigliati per raggiungere gli obiettivi corretti estendendo lungo pre-modellato glial ponteggi di^35,38,39. Così, le cellule gliali sono necessari per la Guida di avanguardia di assoni, che più tardi servono come assone-based “ponteggi vivente” per dirigere la proiezione degli assoni “seguace”. Inoltre, meccanismi di crescita mediata da cellule gliali sono stati indicati a persistere dopo la nascita, come neuroblasti seguono migratori rostrale (RMS) per spostarsi dalla zona subventricolare (SVZ), una delle poche regioni di neurogenesi nel cervello adulto, per il bulbo olfattivo (OB)⁴⁰. Questi neuroblasti nel RMS migrano all’interno del tubo glial (Figura 1A-1), che è costituito da processi astrocitari allineati longitudinalmente, tramite le adesioni cellula-cellula diretto e localizzato fattori solubili^{37, 41}. Infine, mentre danno dello SNC in cause di mammiferi perturbato disposizione astrocytic processo formando una cicatrice gliale che fisicamente impedisce la rigenerazione assonale¹⁷, molti sistemi di mammiferi mancano la formazione di una cicatrice gliale dannosa. Piuttosto, le cellule gliali di specie di mammiferi mantengono più organizzato, allineato modelli che vengono utilizzati come guide attraverso la regione feriti^17,42,43. Per esempio, nei modelli SCI non derivanti da mammiferi, assoni sono mostrati a crescere in stretta associazione con glial ponti che attraversano la lesione, suggerendo un ruolo importante per ponteggi glial organizzati come substrati facilitando la rigenerazione assonale e recupero funzionale ( Figura 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. ricapitolazione delle caratteristiche neuroanatomiche e i meccanismi dello sviluppo/rigenerativo descritti sopra può produrre una nuova classe di derivati dal vivere glial basato su impalcature che contemporaneamente possono guidare immatura migrazione neuronale ed assonale path-finding attraverso ambienti altrimenti non permissivi, quindi potenzialmente mitigare gli effetti di un neurone e la degenerazione del tratto dell’assone associato con lesione dello SNC e malattia.

Il nostro gruppo di ricerca ha già progettato più tipi di ponteggi vivente per la ricostruzione e rigenerazione di axonal tratti nel sistema nervoso centrale e sistema nervoso periferico (PNS) tramite micro-tessuto ingegnerizzato reti neurali (micro-teen) e tessuto innesti ingegnerizzati del nervo (TENGs), rispettivamente^27,46,47,48. Entrambe le strategie dipendono intrinsecamente biomimetica. Micro-teen sono strutture anatomicamente ispirato alla strutturalmente e funzionalmente sostituire axonal tratti collegamento distinte popolazioni neuronali del cervello. TENGs sfruttare il meccanismo inerente allo sviluppo di assone-facilitato la rigenerazione assonale, esemplificato dalla crescita assonale “seguace” lungo gli assoni “pioniere”, per raggiungere la destinazione host la rigenerazione assonale^35,46,48. Abbiamo recentemente sfruttato la versatilità dello scaffold vivente tecnica mediante uno schema simile di encasement come micro-teen e in cerca di ispirazione dai meccanismi basati su cellule gliali presenti nel corso dello sviluppo. Qui, abbiamo sviluppato costrutti costituito da fasci astrocytic allineati che abbracciano il lume collageno di un idrogel micro-colonna⁴⁹. Queste impalcature astrocytic viventi sono state sviluppate da primo riempimento un gruppo di ago di agopuntura-tubo capillare con agarosio liquido per creare un idrogel cavo cilindrico con un diametro esterno (OD) e il diametro interno (ID) corrispondenti ai diametri della tubo ed ago, rispettivamente. A seguito dell’agarosi gelificazione ed estrazione di idrogel micro-colonna dal tubo capillare, interno cavo è rivestito con tipo I collagene per fornire un ambiente permissivo per adesione di astrociti e allineato bundle formazione (Figura 1B -1). In seguito, il lumen è seminato con i astrocytes corticali cerebrali isolati da cuccioli del ratto postnatale (Figura 1B-2). Contrariamente alle tecniche bidimensionali (2D) allineamento che si basano sull’applicazione di campi elettrici, bioerodibili scanalature e matrice extracellulare della proteina (ECM) patterning, allineamento di astrociti nell’impalcatura di vita tecnica si basa sulla auto-assemblaggio secondo variabili controllabili come substrato curvatura (ID di colonna), la densità delle cellule e collagene concentrazione^50,51,52. Gli astrociti contraggono e rimodellano il collagene e di acquisiscono una morfologia bipolare, allineati longitudinalmente analoga per i ponteggi naturali osservati in vivo (Figura 1B-3). Infatti, stiamo attivamente perseguendo l’uso di questi cavo-come le strutture come substrati fisici per un orientamento mirato di migrazione neuroni immaturi, nonché facilitare la rigenerazione assonale attraverso l’ambiente sfavorevole del danneggiato snc, in particolare la cicatrice gliale mammiferi (Figura 1). Questo articolo verrà presentare il metodo di fabbricazione dettagliato per le micro-colonne astrocytic, contrasto e immunofluorescenza immagini della citoarchitettura previsto e per una discussione esaustiva sulle limitazioni attuali e future direzioni di fase i tecnica.

Figura 1: ispirazione, protocollo di fabbricazione e applicazioni proposte per le reti di Astrocytic allineate. Ispirazione neurobiologica (A): (1) neuroblasti provenienti dalla zona subventricular neurogena (SVZ) utilizzano il tubo glial allineato longitudinalmente in rostrale migratori (RMS) per la migrazione diretto verso il bulbo olfattivo (OB); (2) Non-mammiferi come anfibi e pesci possono sostenere la rigenerazione dopo tessuto neurale in parte i danni dovuti alla formazione di un ponte glial che collega le estremità di una lesione (ad es. transected del midollo spinale) e serve come impalcatura per la Guida di assoni di rigenerazione. (B) Panoramica di fabbricazione: (1) costruzione di un’idrogel micron di dimensioni medie, cavo micro-colonna con il lume rivestito con ECM, (2) semina di astrociti corticali primari isolati da cuccioli del ratto postnatale, (3) auto-assemblaggio di longitudinalmente orientati verso il fasci di cultura ed estrazione (4) del fascio dal encasement del biomateriale per gli studi futuri dell’impianto. (C) applicazioni In vivo : (1) Queste impalcature vivente possono servire come tubi gliali ingegnerizzati per migrazione neuronale diretto da neurogene centri per ripopolare le regioni del neurone-carenti; (2) ricapitolazione del meccanismo dello sviluppo di avanguardia di orientamento dell’assone e il meccanismo rigenerativo di glial ponti in non-mammiferi può dotare queste impalcature astrocitari con la capacità di dirigere la rigenerazione assonale attraverso il non permissivi ambiente della cicatrice gliale dei mammiferi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dalle commissioni di utilizzo presso la University of Pennsylvania e la Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center e istituzionali Animal Care e rispettate le linee guida stabilite nei criteri del servizio di sanità pubblica di NIH su Humane Cura e uso degli animali da laboratorio (2015). 1. sviluppo di agarosio Hydrogel Micro-colonne Fare una soluzione di agarosio 3% peso/volume (p/v) di peso 3 g di agarosio e trasferirlo in un recip…

Representative Results

Inizialmente, a contrasto di fase microscopia è stata usata per monitorare la progressione della formazione di adesione e bundle di astrociti e la stabilità generale della citoarchitettura come funzione del tempo. A 1 h dopo il placcaggio, gli astrociti sono stati trovati in tutto il lume delle micro-colonne con una morfologia sferica (Figura 2A). A 5 h, astrociti iniziato estendendo i processi e contraenti, mentre da 8 h cellule hanno esibito una morfologi…

Discussion

Rispetto per l’ambiente più favorevole del PNS, il CNS è notevolmente ridotto a gestire le conseguenze pregiudizievoli di neurotrauma e neurodegenerazione. Dopo un grave insulto al sistema nervoso centrale dei mammiferi, si forma una cicatrice gliale, costituito un nucleo di cellule infiammatorie e fibrotiche circondata da un denso reticolo di astrociti reattivi disorganizzati che secernono assone escrescenza-inibizione proteoglicani¹⁴. Questa cicatrice agisce come un’ostruzione fisica e biochim…

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30×40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).