3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

Summary

우리 쇼케이스 경도 정렬된 astrocytic somata 소설 소재 넣음 내 프로세스의 자기 조립, 3 차원 번들의 개발. 이러한 “생활 건설 기계”, 아직 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘을 공부 하거나 감독 신경 마이그레이션 및 axonal neuroregeneration를 용이 하 게 하 역할 수 센티미터 길이, 확장 미크론 단위 직경을 전시 설계 길입니다.

Abstract

Neurotrauma 및 신경 퇴행 성 질환 자주 손실된 신경 대체 axonal 경로 재생성 하 중앙 신경 시스템 (CNS)의 제한 된 용량으로 인해 신경학 상 적자 지속 될. 그러나, 신 시스템 개발, 신경 마이그레이션 및 axonal 확장 하는 동안 자주 발생 “건설 기계 생활”로 다른 세포에 의해 형성 하는 경로 따라 합니다. 이러한 메커니즘을 에뮬레이션 circumvents CNS의 금지 환경 전략을 디자인 하 고 추구,이 원고 제공 조직 설계를 조작 하는 프로토콜 사이토 기반 “건설 기계 생활”. 이러한 구조를 만들려면, 우리는 바이 폴라 경도 정렬 somata 및 프로세스의 고밀도 3 차원 번들으로 조립 자체 이다 유도 하는 소설 소재 넣음 구조 고용. 첫째, 빈 히드로 마이크로-열 조립 했다, 그리고 내부 루멘 기질-콜라겐 코팅 했다. 해리 대뇌 피 질 이다 다음의 중요 한 내부 직경, 및 원통형 마이크로 열의 루멘으로 배달 되었다 < 350 µ m, 자발적으로 자기 정렬 및 밀도 번들으로 구성 된 긴 섬유 같은 케이블을 생산 하는 계약을 체결 사이토 프로세스와 콜라겐 소 측정의 97% 생존 세포와 거의 독점적으로 했다 이다 표현 하는 중간 필 라 멘 트 단백질 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP), vimentin의 조합 및 nestin의 구성. 이 사이토 네트워크 신경 첨부 파일에 대 한 관대 한 기질을 제공 하는 것을 발견 했다 고 neurite 연장 정렬 정렬. 또한, 이러한 구조에 맞춤 히드로 넣음, CNS 이식 적합 하에서 추출 될 때 무결성 유지 관리 합니다. 이러한 미리 형성한 구조는 구조적으로 자연스럽 게 발생의 주요 cytoarchitectural 요소를 에뮬레이션 “건설 기계 생활” glial 기반 에 비보. 따라서, 이러한 설계 생활 건설 기계 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘에서 생체 외에서 연구 또는 신경 마이그레이션 및 CNS 변성 vivo에서 다음 axonal 길 여 neuroregeneration 촉진 역할 수 있습니다. .

Introduction

중앙 신경 조직 (CNS) 중화 손실 및/또는 신경의 외상 성 뇌 손상 (TBI), 같은 조건이 동반 axonal 경로 장애 제한 용량이 뇌졸중, 척수 상해 (SCI), 및 신경 퇴행 성 질병^{1 ,2,3,,45}. CNS에 신생 방해 손실된 신경^6,7의 복원, 두뇌에 있는 영역의 제한 된 수에 제한 됩니다. 또한, CNS에서 손실된 axonal 통로의 재생 감독된 지침의 부족, 파생물 억제제, 및 신경 조직^{2,8에 손상 다음 반응 astrogliosis의 존재 충분 하지 않습니다. 9,10}. 이다는 일반적으로 이온 항상성, 신경 전달 물질 클리어런스, 시 냅 스 형성, 및¹¹를 커플링 하는 혈관과 신경 지원에 다양 한 기능을가지고. 그럼에도 불구 하 고, 신경 조직에 가벼운 손상, 다음 이다 수 있습니다 받을 분자, 구조적, 기능적 변화 그들은¹¹hypertrophic 상태 전환. 심한 neurotrauma에 대응, 이러한 변경 결과 흉터의 형성에 포함 된 마이그레이션 반응성 이다는 파열된 혈액-뇌 장벽 (BBB) microglia에서 유출 하는 백혈구를 포함 하는 병 변 코어 penumbra oligodendrocytes, 그리고 섬유 아 세포^11,,1213. 이러한 반응성 이다 달성 filamentous, 비 조직 프로세스의 형태 그리고 중간 필 라 멘 트 단백질 및 신경 재생¹²방해 콘 proteoglycans (CSPGs)의 증가 식 전시. Glial 흉터 처음 BBB 무결성을 복원 하 고 건강 한 티슈를 에워싸는 것 염증 반응의 전송을 방지 하는 데 도움이, 비록 그것은 축 삭 재생^{12,14에 대 한 물리적 및 생화학 장벽 역 ,,1516}. 예를 들어, glial 흉터 발생 axons 주먹코 dystrophic 성장 콘을 표시 하 고 성장¹²저하. 또한, 부상 후 astrocytic 프로세스의 해체는 축 삭¹⁷회생의 확장을 방해 한다. 이러한 억제 특성의 결과 종종 영구 신체적, 신경 장애 환자 겪는 심각한 neurotrauma, TBI 및 문화를 포함 한 후에 각 성

외부 직면 CNS 기능 재생에 축 삭 재생성 하는 본질적인 능력을가지고 표시 되었습니다. 예를 들어, glial 흉터 문의 dystrophic 성장 콘의 동적 특성 제안 이러한 엔딩 확장¹²하 그들의 능력을 유지 합니다. 따라서, 그것은 있다고 믿고 axonal 다시 성장에 주요 방해 후 부상 CNS와 감소 glial 흉터 및 흉터에서 재생 다리 것 제공을 통해 더 환경을 제공 하는 금지 환경 유리. 실제로, 이전 학문은 설명 했다 CNS 뉴런 축 삭 재생^{12,18에 대 한 더 많은 유리한 환경을 제시, 교량으로 주변 신경 이식 술을 사용 하 여 병 변을 통해 축 삭 연장 가능 했다 19}. 여러 가지 다른 전략이 흔적 재생 능력을 악용 하 추구 되어 있다. 예를 들어 다양 한 부상 모델에서 세포 성장 신호 통로의 조작 axonal 재생 및 glial 흉터 감소^10,,2021에 결과 있다. 또한, 연구 치료 chondroitinase CSPGs에 설탕 체인의 대부분을 앞, ABC CSPGs 반응 이다²²분 비의 억제 효과 줄이는 나타났습니다. 도 불구 하 고 고무적인 결과, 이러한 방식을 벗어난 재생¹², 잠재적으로 발생할 수 있습니다 하 고 또한 신경의 손실에 대 한 계정을 하지 않습니다 성장 콘의 지도 감독을 제공 하지 않습니다. 셀 기반 접근 시도 glial 흉터의 효과 극복 하 고 보충 손실된 세포, 특히 신경에 이용 되어 있다. 다른 CNS 병 변 축 삭 재생^23,24, 을 추진 하 고 다시 상해 지역에 신경 조상 세포를 이식 하는 동안 일부 그룹 뉴런으로 반응 이다를 dedifferentiated는 ^{그러나 25}., 줄기 세포 이식 혼자 낮은 생존 율, 불 쌍 한 통합 및 손상 된 조직을⁵겸손 보존에 의해 제한 됩니다. 또한, 이러한 세포 기반 전략 제어 방식 특히 장거리 axonal 책자를 복원 실패. 따라서, 다른 접근에와 함께 바이오는 다양 한 신경에 대 한 배달 차량으로 탐험 되 고 조상 세포 및 성장 요인²⁶. 소재 기반 접근 디자인 컨트롤 구문 특정 물리적, haptotaxic 모방 생산의 높은 학위와 대상 호스트 조직^{27의 3 차원 (3D) microenvironment chemotaxic 단서 제시 28,29,30,31,32,,3334}. 이러한 환경 신호 복제는 네이티브 같은 형태학, 확산, 마이그레이션, 및 다른 neurobiological 특성²⁹중 신호 이식된 세포에 대 한 최고입니다. 이러한 유리한 속성 시드 전통적인 셀 소재 건설 기계 넘어 발전은 동시에 감독된 장거리 axonal 재생을 촉진 하 고 손실 된 신경 세포를 대체 하는 데 필요한.

“생활 건설 기계”, 다른 네이티브 neuroanatomy를 에뮬레이트하는 미리 형성한 cytoarchitecture와 살아있는 신경 세포의 존재로 인해 다른 셀 기반 접근을 설계 유망한 다른 접근은 신경 조직 기반 및 타겟된 교체, 개조, 및 신경 회로^4,35의 재생을 촉진 하기 위하여 발달 기계 장치. 건설 기계 생활의 디자인에 대 한 고려 사항 포함 고기 그리고 신경 세포, 기계/물리 속성의 소스 및 생 화 확 적인 신호 어떤 동반 바이오³⁵의 구성에 의해 결정. 제조 후 체 외에, 이러한 생활 건설 기계 이식 수 비보에 현재 세포 접착 분자 및 혈 및 科 신호 신경 세포 이동과 축 삭 가지 상태에 따라 적극적으로 규제를 하 고 재생의 진행^35를처리합니다. Glial 세포는 이후 다양 한 개발 메커니즘에 vivo에서이 세포 중재 건설 기계 생활 설계 된 cytoarchitecture에 대 한 기준으로 사용할 수 있습니다. 두뇌 개발, 새로운 신경 세포 기저 프로세스 개발 외피 격판덮개로 심 실 영역에서 방사형 명과 감독된 마이그레이션^36,37건설 기계 생활으로 확장에 의존 합니다. 또한, 콘은 도표 glial 세포, elicited 매력적이 고 구 충 제 신호를 감지 하 여 스스로 방향을 표시 하 고 소위 “개척” 축 삭 성장 확장 제안 하 고 폐해 미리 패턴을 따라 확장 하 여 올바른 목표 도달 ^35,,3839투어 따라서, glial 세포는 축 삭, 나중으로 축 삭을 기반으로 봉사 하는 개척의 지도에 필요한 “건설 기계 생활” “추종자” 축 삭의 투영을 직접. 또한, 명과 중재 성장 메커니즘 표시 되었습니다 유지 postnatally, neuroblasts 따라 rostral 철새 스트림 (RMS) 帯 (SVZ), 성체 뇌에서 신생의 몇 가지 남아 있는 분야 중 하나에서 탐색 하는 후 각 전구 (OB)⁴⁰. RMS에서이 neuroblasts 경도 정렬 astrocytic 프로세스, 직접 셀 유착을 통해 이루어진 고 성 요인^37, 지역화 glial 튜브 (그림 1A-1), 내 마이그레이션 ⁴¹. 마지막으로, 포유류 원인에 CNS 손상 중단 astrocytic 프로세스 배열 axonal 재생¹⁷를 물리적으로 방해 glial 흉터를 형성 하는 동안 많은 비 포유류 시스템 부족 해로운 glial 흉터의 형성. 오히려, 비 포유류 종의 glial 세포 유지 더 조직, 부상된 지역^17,,4243를 통해 가이드로 사용 되는 패턴을 정렬 합니다. 예를 들어, 비 포유류 과학 모델에서 축 삭 glial 다리 건너 기판 axonal 재생과 기능 회복 (촉진으로 조직 된 폐해 건설 기계에 대 한 중요 한 역할을 제안 하는 병 변와 가까운 협회에서 성장에 표시 됩니다. 그림 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. 신경 해부학 기능 및 위에서 설명한 발달/재생 메커니즘의 재현 부 동시에 미 숙 신경 마이그레이션 구동할 수 조작된 폐해-기반 생활 장비의 새로운 클래스를 얻을 수 있습니다 및 axonal 그렇지 않으면 비 허용 환경, 그로 인하여 잠재적으로 신경의 효과 완화를 통해 길 및 축 삭으로 변성 CNS 상해 및 질병과 관련 된.

연구 그룹은 이전 여러 종류의 재건을 위한 건설 기계 생활 설계 및 CNS와 말 초 신 경계 (PNS) 마이크로 조직 통해 axonal 책자의 재생 신경 네트워크 (마이크로-TENNs) 및 조직 설계 신경 이식 (TENGs), 각각^27,,4647,48를 설계. 두 전략 biomimicry에 근본적으로 근거한 다. 마이크로-TENNs는 해부학 영감 구조 구조적 및 기능적으로 연결 하는 뇌의 뚜렷한 신경 인구 axonal 책자를 대체 하도록 설계 되었습니다. TENGs 축 삭 촉진 axonal 중생, 타겟된 호스트 axonal 재생^35,,4648를 달성 하기 위해 “선구자” 축 삭을 따라 “추종자” 축 삭 성장에 의해 exemplified의 개발 메커니즘을 악용 합니다. 우리는 최근 생활 발판의 다양성에 대문자로 기술 개발을 통해 제시 하는 마이크로 TENNs로 비슷한 넣음 스키마를 사용 하 고 명과 기반 메커니즘에서 영감을 추구. 여기, 우리는 히드로 마이크로 열⁴⁹의 collagenous 루멘에 걸친 정렬된 astrocytic 번들으로 구성 된 구조를 개발 했다. 이러한 astrocytic 생활 건설 기계 만들 해당 직경의 하는 외경 (OD) 및 내경 (ID)와 함께 빈 원통형 히드로 액체 agarose는 모 세관 튜브-침술 바늘 어셈블리를 작성 하 여 개발 되는 튜브와 바늘, 각각. Agarose 겔 화와 히드로 마이크로 열 모 세관 튜브에서 추출, 빈 내부는 유형 나 사이토 접착을 위한 관대 한 환경을 제공 하는 콜라겐 코팅 및 정렬 번들 형성 (그림 1B -1)입니다. 이후에, 루멘은 대뇌 피 질 이다 출생 후 쥐 새끼 (그림 1B-2)에서 절연 된 시드. 2 차원 (2D) 정렬 기법 (ECM) 단백질 패턴, 전기 분야, micropatterned 홈 및 세포 외 매트릭스의 응용 프로그램에 의존 하는 생활 발판에서 사이토 맞춤 반대로 기술에 의존 자기 조립 제어 변수 같은 기판 곡률 (열 ID), 셀 밀도 및 콜라겐 농도^50,,5152에 따르면. 이다 계약, 콜라겐을 리 모델링 하 고 바이 폴라, 경도 정렬 형태에서 관찰 vivo에서 (그림 1B-3) 자연 건설 기계와 유사한 취득. 실제로, 우리는 적극적으로 추구 하 고이 케이블 같은 구조를 사용 하 여 미 성숙한 신경 세포 이주 특히 손상 된 CNS의 불리 한 환경을 통해 axonal 재생 촉진의 대상된 지도 대 한 실제 기판으로 포유류 glial 흉터 (그림 1C). 이 문서는 astrocytic 마이크로-열에 대 한 자세한 제작 방법을 제시, 단계 예상된 cytoarchitecture의 현재 한계에 대 한 포괄적인 토론 명암과 면역 형광 이미지 및의 미래 방향에 기술입니다.

그림 1: 영감, 제조 프로토콜 및 정렬된 Astrocytic 네트워크에 대 한 제안 된 응용 프로그램. (A) Neurobiological 영감: neurogenic 帯 (SVZ)에서 발생 하는 (1) Neuroblasts 후 각 전구 (OB); 향해 감독 마이그레이션 rostral 철새 스트림 (RMS)에 경도 정렬된 glial 관 활용 (2) 비-포유류 양서류, 물고기 등 신경 조직의 병 변 (예: transected 척수)의 끝을 연결 하 고의 지도 위한 비 계 역할 glial 다리의 형성으로 인해 일부 손상 후 재생을 유지할 수 있는 축 삭 재생 (B) 제조 개요: ECM, 코팅 루멘과 미크론 크기, 빈 히드로 마이크로 열의 건설 (1) (2) 기본 외피 이다 출생 후 쥐 새끼, 경도 중심의 (3) 자기 조립에서 고립의 시드 문화와 미래 이식 연구 소재 넣음에서 번들의 (4) 추출에서의 번들 (C) vivo에서 응용 프로그램: (1) 이러한 생활 건설 기계 신경 결핍 지역; 다시 neurogenic 센터에서 감독된 신경 마이그레이션에 대 한 설계 glial 튜브 역할을 수 있습니다 (2) 축 삭 지도 개척의 발달 메커니즘 및 비 포유류에서 glial 교량의 재생 메커니즘의 재현 부 비 허가 걸쳐 축 삭 재생을 직접 수 용량을 가진이 astrocytic 건설 기계를 부여 수 있습니다. 포유류 glial 흉터의 환경입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 펜실베니아 대학의 마이클 J. Crescenz 노 병 사변 의료 센터에 의해 승인 되었고 자비 롭에 NIH 공중 보건 서비스 정책에 명시 된 지침을 준수 관리 및 실험실 동물 (2015)의 사용 합니다. 1. 개발의 Agarose 히드로 마이크로-열 Agarose의 3 g의 무게와 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) 100 mL를 포함 하는 메 마른 비 커에 전송 agarose 3% ?…

Representative Results

처음에, 단계 대조 현미경 검사 법 사이토 접착 및 번들 형성의 진행과 시간의 함수로 cytoarchitecture의 전반적인 안정성을 모니터링 하는 데 사용 되었다. 도금 후 1 시간에서 이다 둥근 형태 (그림 2A)와 마이크로 열의 루멘을 통해 발견 되었다. 5 h 이다 시작 프로세스를 확장 하 고 8 h 여 계약 셀 완전 한 프로세스 베어링 형태를 전시 케이블 마이크로 ?…

Discussion

PNS 더 지원 환경에 비해, CNS neurotrauma 및 neurodegeneration의 해로운 결과 처리에 특히 제한 됩니다. 포유류 CNS에 심각한 모욕 후 glial 흉터 형성, 분열된 반응 이다 축 삭 발전이 억제 proteoglycans¹⁴분 비의 조밀한 meshwork에 둘러싸인 거리 및 염증 세포의 핵심 구성. 이 흉터는 축 삭 엔딩¹²의 재생에 대 한 물리적 및 생화학 방해 역할을 합니다. 또한, 성인 포유류 CNS 복원 …

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30×40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).