Трехмерные ткани спроектированы в соответствие экзоцитоз сетей для пилки развития механизмов и содействия регенерации нервной системы

Summary

Мы витрина развития собственн-собранные, трехмерные связки продольно соответствие Астроцитарная somata и процессов в рамках Роман биоматериала оболочки. Эти инженерии «живые леса», экспонируется микрон шкала диаметр еще расширение сантиметров в длину, могут служить в качестве тест кровать изучения механизмов психомоторного развития или облегчить neuroregeneration направляющие нейронной миграции и/или аксональное Поиск пути.

Abstract

Нейротравма и нейродегенеративные заболевания часто приводят к прочному неврологического дефицита из-за ограниченных возможностей центральной нервной системы (ЦНС) для замены потерянных нейронов и регенерировать аксональное пути. Однако во время развития нервной системы, нейронной миграции и аксональной расширение часто происходят вдоль путей, образованный другие клетки, называют «живые леса». Стремясь подражать Эти механизмы и разработать стратегию, которая обходит среды ингибирующих ЦНС, эта рукопись представляет протокол для изготовления тканей спроектированы на основе экзоцитоз «живые леса». Для создания этих конструкций, мы используем схему оболочки Роман биоматериала, чтобы побудить астроциты самостоятельно собрать в плотной трехмерные жгуты биполярного продольно по краю somata и процессов. Во-первых, полые гидрогеля микро столбцы были собраны, и внутренний просвет был покрыт коллагена внеклеточного матрицы. Диссоциированных мозговой коры астроциты затем были доставлены в просвете цилиндрических микро колонки и в критических внутренний диаметр < 350 мкм, спонтанно самостоятельно выровнены и контракт производить долго волоконно как кабели, состоящий из плотных пучков экзоцитоз процессов и фибрилл коллагена измерения 97% клеток жизнеспособность и были практически исключительно состоит из астроцитов, выражая сочетание промежуточного накаливания белки глиальных фибриллово кислой белка (СВМС), виментин и Нестин. Это соответствие экзоцитоз сетей были найдены для предоставления разрешительной субстрата для нейронов вложения и по краю neurite расширение. Кроме того эти конструкции сохранять целостность и выравнивание при извлечении из гидрогеля оболочки, что делает их пригодными для имплантации ЦНС. Эти предварительно конструкции структурно подражать cytoarchitectural ключевые элементы естественным глиальных на основе «живые леса» в естественных условиях. Таким образом эти инженерии жизни леса могут служить в качестве тест кровать учиться психомоторного развития механизмов в пробирке или облегчить neuroregeneration, направляя нейронной миграции и/или аксональное пути после ЦНС дегенерации в естественных условиях .

Introduction

Центральной нервной системы (ЦНС) имеет ограниченные возможности противодействовать потери и/или дисфункции нейронов и аксональной пути, которые сопровождают условий, таких как черепно-мозговой травмы (ЧМТ), инсульт, травме (ТСТ) и нейродегенеративных заболеваний спинного^{1 ,}–^2,–^3,–^4,–⁵. Нейрогенез в ЦНС ограничивается ограниченное количество областей в мозге, препятствует восстановлению утраченных нейронов^6,7. Кроме того восстановление утраченных аксональное путей в ЦНС недостаточно из-за отсутствия направленного указаний, присутствие ингибиторов нарост и реактивной astrogliosis после повреждения нервной ткани^{2,8, 9,10}. Астроциты, как правило, имеют различные функции в деле оказания помощи нейронов с ионного гомеостаза, Распродажа нейромедиатора, формирования синапсов и нервно-сосудистых муфты¹¹. Тем не менее после даже умеренные повреждения нервной ткани, астроциты могут пройти молекулярные, структурные и функциональные изменения, как они переход к гипертрофических состояние¹¹. В ответ на серьезные нейротравма эти изменения приводят к формированию шрам с полутень, содержащие перенос реактивной астроциты и поражения ядро, которое включает в себя лейкоциты, утечка из расколовшегося гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), микроглии, Олигодендроциты и фибробласты^11,12,13. Эти реактивные астроциты достичь морфология нитевидные, неорганизованное процессов и демонстрируют увеличение выражение промежуточного накаливания белков и протеогликаны хондроитин сульфат (CSPGs), которые препятствуют нейронная регенерация¹². Несмотря на то, что глиальный рубец первоначально помогает восстановить целостность BBB и избежать передачи воспалительной реакции на окружающие здоровые ткани, он служит физических и биохимических барьер против регенерации аксона^{12,14 ,,1516}. Например аксоны которых сталкиваются глиальный рубец отображения луковичных дистрофические роста шишки и сдерживали рост¹². Кроме того дезорганизация Астроцитарная процессов после травмы препятствует расширение регенерировать аксоны¹⁷. Итоги этих характеристик тормозной проявляется в часто постоянного физические и неврологические расстройства, которые пациенты страдают после тяжелой нейротравма, включая ЧМТ и SCI.

Независимо от того, внешние задачи, стоящие перед функциональным регенерации в ЦНС аксоны было показано, обладают внутреннюю способность к регенерации. Например динамический характер дистрофические роста конусов при контакте с глиальный рубец свидетельствует о том, что эти окончаний сохраняют свою способность расширять¹². Следовательно считается, что основным препятствием для аксональное re рост является среды ингибирующих после травмы ЦНС и что предоставление более питательную среду через сокращение глиальных рубцов и/или предоставление восстановительной мосты через шрам будет выгодно. Действительно предыдущие исследования показали, что нейронов ЦНС способны расширения аксоны через поражения с помощью периферических нервов графтов как мосты, которые создают более благоприятные условия для axon регенерации^{12,18, 19}. Ряд других стратегий предпринимались эксплуатировать этот рудиментарный регенеративной способностью. К примеру манипуляции клеток роста сигнальных путей в различных моделях травмы привело к аксональное регенерации и глиальных Шрам сокращения^10,,2021. Кроме того исследования показали, что лечение с chondroitinase ABC, который расщепляет большинство цепочки сахара в CSPGs, уменьшает эффект CSPGs, выделяемый реактивной астроциты²². Несмотря на обнадеживающие результаты, эти подходы не дают направлен руководством конусы роста, которые потенциально может приводить к аномальным регенерации¹², а также не учитывают потери нейронов. Подходы на основе клеток были использованы в попытках преодолеть последствия глиальный рубец и пополнить потерянные клеток, особенно нейронов. Некоторые группы Дедифференцированная реактивной астроциты в нейроны, в то время как другие пересажены нейронных прогениторных клеток в поражениях ЦНС населить области травмы и поощрять аксона регенерации^{23,24, 25}. Однако, трансплантация стволовых клеток только ограничивается низкой выживаемости, плохое интеграции и скромный удержания в поврежденной ткани⁵. Кроме того эти стратегии на основе клеток удастся восстановить междугородной аксональное участки, особенно в контролируемым образом. Таким образом биоматериалов в сочетании с другими подходами в настоящее время изучаются как средства доставки для различных нейронных и клеток-предшественников и роста факторы²⁶. Подходы на основе биоматериала имеют высокую степень управления дизайн для производства конструкций, которые имитируют конкретные физические, haptotaxic, и chemotaxic сигналы в трехмерной (3D) микроокружения целевого узла ткани^{27, 28,29,30,,3132,,3334}. Воспроизведение этих экологических сигналов имеет первостепенное значение для пересаженные клетки представить родной как морфология, распространения, миграции и сигнализации, среди других нейробиологических характеристики²⁹. Несмотря на эти выгодные свойства улучшению за пределами традиционных клеток посеян биоматериала подмостей требуется одновременно направлены междугородной аксональное регенерации и заменить потерянные нейронов.

Обещая альтернативный подход основан на нервной ткани инженерии «живые леса», которые отличаются от других подходов, основанных на ячейки, из-за присутствия живых нервных клеток с предварительно cytoarchitecture, что эмулирует родной нейроанатомия и/или развития механизмов для облегчения целевых замена, восстановление и регенерация нейронной схемы^4,35. Соображения по проектированию жизни леса включают фенотипы и источники нервные клетки, а также механические/физические свойства и биохимические сигналы продиктовано состав любых сопровождающих биоматериалов³⁵. После изготовления в пробирке, эти живые леса может быть имплантирован в естественных условиях настоящего молекул клеточной адгезии и эозинофилов и нейротрофическими сигналы активно регулировать миграцию нервных клеток и аксон нарост в зависимости от государства и прогрессирование регенераторные процессы³⁵. Глиальные клетки может служить основой для инженерных cytoarchitecture жизни леса, так как эти клетки посредником различные механизмы развития в естественных условиях. Во время развития мозга новые нейроны полагаются на базальную процессы, продлен на радиальной глии из желудочков зоны к развивающихся корковых пластины как живые леса для миграции направлены^36,37. Кроме того расширение роста шишки показано ориентироваться по зондирования привлекательным и репелленты сигналы с ориентиром глиальных клеток и так называемые «первопроходца» аксоны предлагается достичь правильной цели, расширяя вдоль заранее узорной глиальных помостами^35,,3839. Таким образом, глиальные клетки необходимы для руководства первопроходца аксонов, которые впоследствии служат как на основе аксон «живые леса» в прямой проекции «последователь» аксоны. Кроме того, механизмы роста глии опосредованной было показано постнатально, сохраняются как нейробласты следовать ростральной миграционных потока (RMS) для перехода из субвентрикулярной зоны (SVZ), один из немногих оставшихся областей нейрогенез взрослого мозга, обонятельные луковицы (OB)⁴⁰. Эти нейробласты в RMS мигрируют в глиальных трубки (рис. 1а-1), который состоит из продольно в соответствие Астроцитарная процессов, через прямой ячеек спаек и локализованные растворимых факторов^{37, 41}. Наконец, хотя повреждения ЦНС в млекопитающих причин нарушается механизм Астроцитарная процесса формирования глиальных шрам, который физически препятствует аксональное регенерации¹⁷, многие системы не млекопитающих не хватает формирования глиальных наносит шрам. Скорее глиальные клетки не млекопитающих видов поддерживать более организованной, соответствие шаблонов, которые используются в качестве руководства через пострадавшего региона^17,42,43. Например в моделях SCI не млекопитающих, аксоны показываются расти в тесном сотрудничестве с глиальных мосты, пересекая поражения, предлагая важную роль для организованных глиальных леса как субстратов, содействия аксональное регенерации и восстановления функций ( Рисунок 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. перепросмотре нейроанатомический функций и развития/восстановительных механизмов, описанных выше может принести новый класс инженерии глиальных основе жизни леса, которые могут одновременно управлять незрелых нейронной миграции и аксональной Поиск пути через иначе либеральной среды, тем самым потенциально смягчения последствий нейронов и аксон тракта дегенерации, связанные с ЦНС травмы и болезни.

Наша исследовательская группа ранее разработала несколько типов живых подмости для восстановления и регенерации аксональное участки в ЦНС и периферической нервной системы (ПНС) через микро ткани спроектирован нейронных сетей (микро TENNs) и ткани графтов инженерии нерва (TENGs), соответственно^27,46,47,48. Обе стратегии по существу основаны на biomimicry. Микро-TENNs являются анатомически вдохновил сооружения, предназначенные для структурно и функционально заменить аксональное участки, подключение различных нейрональных популяций головного мозга. TENGs использовать механизму развития аксон способствовали аксональное регенерации, подтверждается «последователь» аксон роста вдоль аксоны «Пионер», для достижения целевой хост аксональное регенерации^35,46,48. Мы недавно капитализируются на универсальность живых эшафот техника с использованием аналогичной схемы оболочки как микро TENNs и ищет вдохновение от механизмов на основе глии представить на протяжении развития. Здесь мы разработали конструкции, состоящей из унифицированных Астроцитарная связки, охватывающих коллагеновых люмен гидрогеля микро колонки⁴⁹. Эти леса Астроцитарная жизни, разработанные Первое заполнение сборку капиллярной трубки иглоукалывание иглы с жидким агарозы для создания полые цилиндрические гидрогеля с внешнего диаметра (OD) и внутренний диаметр (ID) соответствующих диаметров трубки и иглы, соответственно. После геля агарозы и извлечение микро столбце гидрогеля с капиллярной трубки, полые интерьер является покрытием с типом коллаген предоставлять среде разрешительных для экзоцитоз адгезии и соответствие комплекта формирования (рис. 1B -1). После этого просвет заполняется с мозговой коры астроциты, изолированы от послеродового крыса щенков (Рисунок 1B-2). Вопреки двухмерный (2D) выравнивания методы, которые полагаются на применение электрических полей, micropatterned канавки и внеклеточного матрикса (ECM) белка кучность, экзоцитоз выравнивания в жизни леса способ полагается на самостоятельной сборки по данным контролируемых переменных, таких как субстрат кривизны (столбец ID), плотность ячеек и коллаген концентрации^50,51,52. Астроциты контракт и перестроить коллагена и приобрести биполярный, продольно соответствие морфологии, аналог природных лесов, наблюдается в vivo (рис. 1B-3). Действительно мы активно осуществляем использование этих кабель подобных структур как физические субстратов для целенаправленного руководства миграции незрелых нейронах, а также содействия аксональное регенерации в неблагоприятной окружающей среде повреждения ЦНС, особенно млекопитающих глиальный рубец (рис. 1 c). Эта статья представит подробные изготовления для Астроцитарная микро колонки, фаза контраст и иммунофлюоресценции изображения ожидаемого cytoarchitecture и всеобъемлющее обсуждение текущих ограничений и будущие направления деятельности техника.

Рисунок 1: вдохновение, изготовление протокол и предлагаемых приложений для выровненного Астроцитарная сетей. (A) нейробиологических вдохновение: (1) нейробласты возникая от нейрогенный субвентрикулярной зоны (SVZ) использовать продольно унифицированных глиальных трубки в ростральной миграционных потока (RMS) для направленного миграции к обонятельной луковицы (OB); (2) Non млекопитающих, таких как амфибий и рыб могут поддерживать регенерации после нервной ткани ущерб отчасти за счет формирования глиальных мост, который соединяет заканчивается поражением (например пересекал спинного мозга) и служит леску для руководства регенерирующее аксоны. (B) Обзор изготовления: (1) строительство микро столбца микронного размера, полые гидрогеля с люмен, покрытые ECM, (2) заполнение первичной коры астроциты, изолированы от послеродового крыса детенышей, (3) самосборки продольно ориентированных связки в культуре и (4) добыча комплект из оболочки биоматериала для исследования будущей имплантации. (C) в естественных условиях применения: (1) эти живые леса могут служить инженерии глиальных трубы для направленного нейрон миграции из нейрогенный центров, чтобы населить нейрон недостаточным регионов; (2) резюме развития механизма новаторской руководство аксона и регенеративной механизм глиальных мостов в не млекопитающих может наделить эти Астроцитарная леса с способностью прямой регенерации аксона через не разрешительной окружающей среды млекопитающих глиальный рубец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

Все процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование комитетами в университете штата Пенсильвания и Майкл J. Crescenz ветеранов медицинский центр управления по делам и придерживаться руководящих принципов, изложенных в политике службы общественного здравоохранен…

Representative Results

Первоначально, фазово контрастной микроскопии был использован для контролировать прогрессирование экзоцитоз адгезии и расслоение формирования и общей стабильности cytoarchitecture как функцию от времени. В 1 ч после покрытия астроциты были найдены во всем люмен микро колон…

Discussion

По сравнению с более благоприятной среды ПНС, ЦНС в обработке негативные последствия нейротравма и нейродегенеративные особенно ограничено. После серьезным оскорблением млекопитающих ЦНС глиальный рубец образуется, состоящий из основного фиброзных и воспалительных клеток, окруженн…

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30×40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).