Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Summary

Nos muestra el desarrollo de los paquetes uno mismo-montado, tridimensionales de somata astrocytic longitudinalmente alineado y procesos dentro de un protector nuevo biomaterial. Estos diseñados “andamios de vida”, que diámetro de la escala del micrón pero extiende centímetros de longitud, puede servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico o facilitar la Neurorregeneración por dirige la migración neuronal y axonal pathfinding.

Abstract

Neurotrauma y neurodegenerative de la enfermedad a menudo resultan en duradero déficit neurológico debido a la limitada capacidad del sistema nervioso central (SNC) para reemplazar las neuronas perdidas y regenerar caminos axonales. Sin embargo, durante el desarrollo del sistema nervioso, la migración neuronal y la extensión axonal ocurren a menudo por caminos formados por otras células, conocido como “andamios de vida”. Buscando emular estos mecanismos y diseñar una estrategia que evita el entorno inhibidor del SNC, este manuscrito presenta un protocolo para fabricar ingeniería tisular basada en astrositos “andamios de vida”. Para crear estas construcciones, se empleó un esquema protector de nuevo biomaterial inducir astrocitos uno mismo-montar en densos paquetes tridimensionales de somata bipolar alineados longitudinalmente y procesos. Hidrogel en primer lugar, hueco micro-columnas estaban reunidos, y la luz interior estaba recubierta con matriz extracelular colágeno. Astrocitos corticales cerebrales disociados luego fueron entregados en el lumen de la micro-columna cilíndrica y un diámetro interior crítico de < 350 μm, espontáneamente auto alineado y contratado para producir largas de fibra como cables consisten en paquetes densos de los procesos de astrositos y fibrillas de colágeno de medición 97% viabilidad celular y eran casi exclusivamente compuesta por astrocitos expresan una combinación del filamento intermedio proteínas glial fibrilar proteína ácida (GFAP), vimentina y nestin. Estos alinean astrositos redes fueron encontradas para proporcionar un substrato permisivo para conexión neuronal y alineación la extensión del neurite. Por otra parte, estas construcciones mantienen integridad y alineación cuando extrae del protector de hidrogel, haciéndolas adecuadas para la implantación de la CNS. Estas construcciones preformadas estructuralmente emulan citoarquitectónica clave elementos de origen natural basada en glial “andamios de vida” en vivo. Como tal, estos andamios de ingeniería de la vida pueden servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico en vitro o facilitar la Neurorregeneración dirigiendo la migración neuronal y axonal pathfinding tras degeneración CNS en vivo .

Introduction

Sistema nervioso central (SNC) tiene una capacidad limitada para contrarrestar la pérdida o disfunción de las neuronas y vías axonales que acompañan las condiciones tales como lesión cerebral traumática (TBI), movimiento, médula espinal lesión (SCI) y neurodegenerative enfermedad^{1 ,2,3,4,5}. Neurogénesis en el SNC se limita a un número limitado de áreas en el cerebro, dificultando la restauración de las neuronas perdidas^6,7. Además, la regeneración de caminos perdidas axonales en el SNC es insuficiente debido a la falta de orientación dirigida, la presencia de inhibidores de la consecuencia y astrogliosis reactiva después de daño al tejido neural^{2,8, 9,10}. Los astrocitos tienen diversas funciones para ayudar a las neuronas con la homeostasis de iones, separación de neurotransmisores, formación de sinapsis y neurovasculares acoplamiento¹¹. Sin embargo, siguiendo incluso leves daños de tejido neural, astrocytes pueden sufrir cambios moleculares, estructurales y funcionales en su transición a un estado hipertrófico¹¹. En respuesta al neurotrauma grave, estos cambios resultan en la formación de una cicatriz con una penumbra que contienen astrocitos reactivos migrando y un núcleo de la lesión que incluye leucocitos se filtró desde el rota barrera blood – brain (BBB), microglia, oligodendrocitos y fibroblastos^11,12,13. Estos astrocitos reactivos logran una morfología de procesos filamentosos, desorganizados y presentan aumento de la expresión de proteínas de filamentos intermediarios y proteoglicanos de sulfato del chondroitin (CSPGs), que impiden la regeneración de los nervios¹². A pesar de la cicatriz glial inicialmente ayuda a restaurar la integridad de la BBB y evitar la transmisión de la respuesta inflamatoria al tejido sano circundante, sirve como una barrera física y bioquímica contra axon regeneración^{12,14 ,15,16}. Por ejemplo, axones que encuentran la cicatriz glial mostrar los conos de crecimiento distrófico con bulbo y retraso de crecimiento¹². Además, la desorganización de los procesos astrocytic después de la lesión impide la extensión de regenerar axones¹⁷. El resultado de estas características inhibitorias se manifiesta en las debilitaciones físicas y neurológicas a menudo permanente que los pacientes sufren después de neurotrauma grave, incluyendo TBI y la médula espinal.

Independientemente de los retos extrínsecos de regeneración funcional en el SNC, axones han demostrado poseer una capacidad intrínseca de regeneración. Por ejemplo, la naturaleza dinámica de los conos de crecimiento distrófico en contacto con la cicatriz glial sugiere que estas terminaciones conservan su capacidad para ampliar a¹². En consecuencia, se cree que un obstáculo principal para el crecimiento axonal es el entorno inhibidor del SNC después de la lesión y proporciona un ambiente más permisivo a través de reducción de la cicatrización glial o proporcionar puentes regenerativas a través de la cicatriz sería ventajoso. De hecho, estudios anteriores han demostrado que las neuronas de la CNS fueron capaces de extender axones a través de una lesión mediante injertos de nervios periféricos como puentes, que presentan un entorno más favorable para la regeneración de axón^{12,18, 19}. Varias otras estrategias han sido llevadas a cabo para explotar esta capacidad regenerativa vestigial. Por ejemplo, manipulación de vías de señalización de crecimiento celular en varios modelos de lesión ha dado lugar a la regeneración axonal y disminución de cicatriz glial^10,20,21. Además, los estudios han demostrado que el tratamiento con Condroitinasa ABC, que hiende la mayoría de las cadenas de azúcar en CSPGs, disminuye el efecto inhibitorio de CSPGs segregada por los astrocitos reactivos²². A pesar de alentador resultados, estos métodos no proporcionan dirigida orientación de conos de crecimiento, que potencialmente puede resultar en la regeneración aberrante¹²y también no tienen en cuenta para la pérdida de neuronas. Enfoques basados en la célula se han utilizado en tentativas de superar los efectos de la cicatriz glial y para reponer las células perdidas, particularmente de las neuronas. Algunos grupos han dedifferentiated astrocitos reactivos en las neuronas, mientras que otros han trasplantado células progenitoras neurales en lesiones CNS para repoblar la zona de lesión y promover axon regeneración^{23,24, 25}. sin embargo, la célula de vástago trasplante solo está limitado por las tasas de supervivencia bajas, pobre integración y retención modesta en el tejido dañado⁵. Además, estas estrategias basadas en células incapaces de restaurar zonas interurbana axonal, especialmente en forma controlada. Por lo tanto, biomateriales en combinación con otros enfoques se están estudiando como vectores para varios nervios y factores de crecimiento y células progenitoras²⁶. Enfoques basados en el biomaterial cuentan con un alto grado de control del diseño para producir construcciones que imitan a la haptotaxic física, específica, y chemotaxic señales presentan en el microambiente (3D) tridimensional del destino anfitrión tejido^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproducción de estas señales ambientales es de suma importancia para las células trasplantadas presentar nativo-como morfología, proliferación, migración y señalización, entre otras características neurobiológicas²⁹. A pesar de estas propiedades ventajosas, avance más allá de la tradicional células sembradas biomaterial andamios es necesario simultáneamente promover la regeneración axonal larga distancia dirigida y reemplazar las neuronas perdidas.

Un prometedor enfoque alternativo se basa en el tejido neural ingeniería “andamios de vida”, que son distintos de otros enfoques basados en la célula debido a la presencia de células neuronales vivas con una Citoarquitectura preformado que emula neuroanatomía nativa o desarrollo mecanismos que faciliten la sustitución específica, reconstrucción y regeneración de los circuitos neuronales^4,35. Consideraciones para el diseño de matrices de soporte de vida incluyen los fenotipos y las fuentes de las células neuronales, así como las propiedades físico mecánicas y las señales bioquímicas dictaron por la composición de cualquier adjunto de biomateriales³⁵. Después de la fabricación en vitro, estos andamios de vida pueden ser implantados en vivo quimiotácticos y moléculas de adhesión celular presentes y neurotróficos señales para regular activamente migración de células neuronales y consecuencia del axón dependiendo del estado y progresión de procesos regenerativos³⁵. Las células gliales pueden servir como base para la ingeniería Citoarquitectura de andamios de la vida ya que estas células median varios mecanismos del desarrollo en vivo. Durante el desarrollo del cerebro, las neuronas nuevas dependen de procesos basals extendidos por glia radial desde la zona ventricular hacia la placa cortical en vías de desarrollo como andamios de vida migración dirigida^36,37. Además, extender crecimiento conos son muestra a orientarse detectando señales atractivas y repulsivo provocadas por las células gliales hito y supuesto “pioneras” axones son sugeridas para alcanzar los objetivos correctos por que se extiende a lo largo de los estampados glial Andamios de^38,35,39. Así, las células gliales son necesarias para la dirección del pionero axons, que luego sirven como base de axon “andamios de vida” para dirigir la proyección de axones “seguidor”. Por otra parte, mecanismos de crecimiento mediada por la glía han demostrado persistencia postnatal, como neuroblastos siguen la corriente migratoria rostral (RMS) para poder navegar desde la zona subventricular (SVZ), una de las pocas áreas restantes de la neurogénesis en el cerebro adulto, la bulbo olfatorio (OB)⁴⁰. Estos neuroblastos en el RMS migran dentro del tubo de glial (figura 1A-1), que se compone de procesos astrocytic alineadas longitudinalmente, mediante adhesiones célula-célula directa y localizada de factores solubles^{37, 41}. por último, mientras que el daño del CNS en causas de mamíferos interrumpió arreglo astrocytic proceso formando una cicatriz glial que físicamente impide la regeneración axonal¹⁷, muchos sistemas no mamíferos carecen de la formación de una cicatriz glial perjudicial. Más bien, las células gliales de las especies de animales no mamíferos mantienen más organizado, alineados los patrones que se utilizan como guías a través de la región lesionada^17,42,43. Por ejemplo, en modelos de animales no mamíferos SCI, se muestran axones que crecen en estrecha asociación con puentes gliales cruzar la lesión, lo que sugiere un papel importante para andamios gliales organizados como sustratos facilitando la regeneración axonal y recuperación funcional ( Figura 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. recapitulación de las características neuroanatómicas y los mecanismos del desarrollo/regenerativa descritos anteriormente puede producir una nueva clase de andamios de ingeniería vida glial base que puede conducir al mismo tiempo la migración neuronal inmadura y axonal pathfinding a través de entornos no permisiva, de tal modo potencialmente mitigar los efectos de neuronal y degeneración de la zona de axón asociado a enfermedad y lesión del CNS.

Nuestro grupo de investigación previamente ha diseñado varios tipos de matrices de soporte de vida para la reconstrucción y regeneración del tracto axonal en el SNC y sistema nervioso periférico (SNP) a través de micro-tejido ingeniería de redes neuronales (micro-adolescentes) y tejido Ingeniería injertos del nervio (TENGs), respectivamente^27,46,47,48. Ambas estrategias están basados inherentemente en biomimética. Micro-adolescentes son estructuras anatómicamente inspiración estructural y funcionalmente sustituye extensiones axonales conectar distintas poblaciones neuronales del cerebro. TENGs explotan el mecanismo del desarrollo de la regeneración axonal facilitado por axon, ejemplificado por el crecimiento del axon de “seguidor” a lo largo de axones de “pionero”, para lograr la regeneración axonal de host destino^35,46,48. Nos recientemente aprovechó la versatilidad de la matriz de soporte de vida técnica mediante un esquema similar de protector como micro-adolescentes y buscando inspiración en los mecanismos basados en la glia presentes en todo el desarrollo. Aquí, hemos desarrollado construcciones consisten en paquetes astrocytic alineados que atraviesan el lumen colagenoso de una micro columna de hidrogel⁴⁹. Estos andamios vida astrocíticos son desarrollados por el primer llenado de un conjunto de agujas de acupuntura de tubo capilar con agarosa líquida para crear un hidrogel cilíndrico hueco con un diámetro exterior (OD) y diámetro interno (ID) correspondiente a los diámetros de la tubo y aguja, respectivamente. Gelificación de agarosa y extracción de la hidrogel micro-columna de tubo capilar, el hueco interior es revestido con tipo y colágeno para suministrar un entorno permisivo para la adherencia de astrositos y alineado paquete formación (figura 1B -1). Luego, la luz es sembrada con astrocitos corticales cerebrales aislados de crías de rata postnatal (figura 1B-2). Contrariamente a las técnicas bidimensionales (2D) alineación que se basan en la aplicación de campos eléctricos, micropatterned surcos y matriz extracelular proteína (ECM) patrones, alineación de astrositos en el andamio de la vida técnica depende de uno mismo-Asamblea de acuerdo a las variables controlables como curvatura de sustrato (columna ID), la densidad celular y la concentración de colágeno^50,51,52. Los astrocitos contratan y remodelan el colágeno y adquieran una morfología bipolar, alineados longitudinalmente análoga a las matrices de soporte naturales en vivo (figura 1B-3). De hecho, estamos persiguiendo activamente el uso de estas estructuras de cable como sustratos físicos específicos guía de migración de las neuronas inmaduras, así como facilitar la regeneración axonal a través del ambiente desfavorable del SNC dañado, particularmente la cicatriz glial mamífera (figura 1). Este artículo se presenta el método de fabricación detallado para las columnas de micro astrocytic, fase imágenes de contraste, inmunofluorescencia y de la Citoarquitectura esperado y una amplia discusión sobre las limitaciones actuales y direcciones futuras de la técnica.

Figura 1: inspiración, protocolo de fabricación y aplicaciones propuestos para las redes Astrocytic alineadas. (A) inspiración neurobiológica: neuroblastos (1) origina la neurogénica zona subventricular (SVZ) utilizan el tubo glial longitudinalmente alineado en la corriente migratoria rostral (RMS) para la migración dirigida hacia el bulbo olfatorio (OB); (2) no de mamíferos como peces y anfibios pueden sostener la regeneración después de tejido neural dañar en parte debido a la formación de un puente glial que conecta los extremos de una lesión (por ejemplo médula espinal transected) y sirve como un andamio para la dirección de regeneración de axones. (B) Resumen de fabricación: (1) construcción de una micro columna hidrogel de tamaño micrométrico, hueco con recubierta de ECM, la luz de la (2) siembra de astrocitos corticales primarios aislados de crías de rata postnatal, (3) uno mismo-Asamblea de longitudinalmente orientados paquetes en la cultura y (4) extracción del paquete del encasement del biomaterial para estudios de implantación futura. (C) In vivo usos: (1) estos andamios de vida pueden servir como tubos gliales ingeniería para la migración de la neurona dirigida de centros neurogénicas a repoblar las regiones deficientes en neurona; (2) Resumen del mecanismo del desarrollo de pioneras orientación axón y el mecanismo regenerativo de puentes gliales en los mamíferos no puede dotar a estos andamios astrocytic con capacidad de dirigir la regeneración del axón a través de la no-permisivo medio ambiente de la cicatriz glial mamífera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y comités de uso en la Universidad de Pennsylvania y el centro médico de Michael J. Crescenz veteranos asuntos y adheridos a las directrices establecidas en la Directiva de servicio de salud pública de NIH en humano Uso y cuidado de animales de laboratorio (2015). 1. desarrollo de las Micro hidrogel-columnas de agarosa Pesar 3 g de agarosa y transferirla a un vaso de precipitados estéril que contiene…

Representative Results

Inicialmente, fase-pone en contraste microscopia fue utilizada para supervisar la progresión de astrositos adherencia y paquete de formación y la estabilidad general de la Citoarquitectura en función del tiempo. A 1 h después de la galjanoplastia, los astrocytes fueron encontrados a lo largo del lumen de las columnas de micro con una morfología esférica (figura 2A). En 5 h, astrocitos comenzaron ampliar procesos y contratación, mientras que 8 h célula…

Discussion

En comparación con el entorno más propicio del PNS, el SNC se ve particularmente limitado en el manejo de las consecuencias perjudiciales de neurotrauma y neurodegeneración. Después de un grave insulto al SNC mamífero, se forma una cicatriz glial, consistente en un núcleo de células inflamatorias y fibróticas rodeado por una densa red de astrocitos reactivos desorganizados que secretan axón inhibidor consecuencia proteoglicanos¹⁴. Esta cicatriz actúa como una obstrucción física y bioqu…

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30×40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).