Hier presenteren wij een protocol voor het opnemen van ritmische neuronale netwerk theta en gamma oscillaties vanuit een geïsoleerde hele hippocampale voorbereiding. We beschrijven de experimentele stappen van extractie van de hippocampus naar details van veld-, eenheids- en hele-cel patch-klemopnamen, evenals optogenetische stimulatie van het theta ritme.
Dit protocol beschrijft de procedures voor het opstellen en opnemen van de geïsoleerde gehele hippocampus, van WT en transgene muizen, samen met recente verbeteringen in methodologieën en toepassingen voor de studie van theta-oscillaties. Een simpele karakterisering van het geïsoleerde hippocampale preparaat wordt gepresenteerd waarbij de relatie tussen interne hippocampale theta-oscillators samen met de activiteit van pyramidale cellen en GABAergische interneuronen van de cornu ammonis-1 (CA1) en subiculum (SUB) gebieden wordt onderzocht. In het algemeen tonen we aan dat de geïsoleerde hippocampus in vitro intrinsieke theta-oscillaties kan opwekken en dat ritmiciteit die in de hippocampus wordt gegenereerd, nauwkeurig gemanipuleerd kan worden door optogenetische stimulatie van parvalbumine-positieve (PV) interneuronen. De in vitro geïsoleerde hippocampale voorbereiding biedt een unieke kans om gelijktijdige veld- en intracellulaire patch-klemopnamen te gebruiken van visueel geïdentificeerd neuRons om de mechanismen van de theta ritme generatie beter te begrijpen.
Hippocampale theta-oscillaties (4-12 Hz) behoren tot de meest overheersende vormen van ritmische activiteit in de zoogdierbrein en worden geacht belangrijke sleutelrol te spelen in cognitieve functies zoals de verwerking van spatiotemporale informatie en de vorming van episodische herinneringen 1 , 2 , 3 . Terwijl verscheidene in vivo studies die de relatie van theta-gemoduleerde plaatscellen met ruimtelijke navigatie- en letselstudies beklemtonen, evenals klinisch bewijs, ondersteunen het standpunt dat hippocampale theta-oscillaties betrokken zijn bij geheugenvorming 4 , 5 , 6 , de mechanismen Bij de opwekking van hippocampale theta-oscillaties worden nog steeds niet volledig begrepen. Vroege in vivo onderzoeken suggereerden dat theta activiteit voornamelijk afhankelijk was van extrinsieke oscillators, in het bijzonder ritmische invoerVan afferente hersenstructuren zoals de septum en entorhinaire cortex 7 , 8 , 9 , 10 . Een rol voor intrinsieke factoren – interne connectiviteit van hippocampale neurale netwerken, samen met de eigenschappen van hippocampale neuronen – werd ook gepostuleerd op basis van in vitro waarnemingen 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Echter, afgezien van enkele landmarkstudies 19 , 20 , 21 , moeilijkheden bij het ontwikkelen van benaderingen die fysiologisch realistische populatieactiviteiten kunnen repliceren in eenvoudige in vitro- snijbereidingS hebben langdurig gedetailleerd experimenteel onderzoek van de intrinsieke capaciteiten van de hippocampus en aanverwante gebieden vertraagd om theta-oscillaties zelf te genereren.
Een belangrijk nadeel van de standaard in vitro thin-slice experimentele instelling is dat de 3D-cellulaire en synaptische organisatie van hersenstructuren gewoonlijk wordt gecompenseerd. Dit betekent dat veel vormen van gecoördineerde netwerkactiviteiten die zijn gebaseerd op ruimtelijk verdeelde celsamenstellingen, variërend van gelokaliseerde groepen (≤1 mm radius) naar populaties van neuronen die zich verspreiden over een of meer hersengebieden (> 1 mm) niet kunnen worden ondersteund. Gezien deze overwegingen was een ander soort aanpak nodig om te bestuderen hoe theta-oscillaties zich in de hippocampus voordoen en zich verspreiden naar verwante corticale en subcortische uitvoerstructuren.
In de afgelopen jaren is de initiële ontwikkeling van de "complete septo-hippocampale" voorbereiding om bi-directionele interaCtions van de twee structuren 22 en de daaropvolgende evolutie van de "geïsoleerde hippocampus" -bereiding hebben aangetoond dat intrinsieke theta-oscillaties spontaan optreden in de hippocampus die de externe ritmische ingang 23 mist. De waarde van deze benaderingen ligt op het initiële inzicht dat de gehele functionele structuur van deze regio's behouden moest worden om in vitro 22 als een theta-ritmegenerator te kunnen functioneren.
Terwijl elektrofysiologische opnamen van acute hippocampale plakjes een standaard in vitro techniek vormen, verschillen de methoden die hier worden gepresenteerd aanzienlijk van de klassieke aanpak. In tegenstelling tot de dunne plakpreparaten waar specifieke cellagen zichtbaar zijn op het oppervlak en direct kunnen worden onderzocht, zijn de intacte hippocampale preparaten meer vergelijkbaar met in vivo configuraties, waarbij elektroden worden verlaagd naar gerichte hersenregio's terwijl ze door a…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek en natuurwetenschappen.
Reagents | |||
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Animals | |||
PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |