Tuning dans la bande Hippocampal Theta In Vitro: Méthodologies pour l'enregistrement à partir du circuit de Septohippocampal de Rongeur isolé

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour l'enregistrement du réseau neuronal rythmique theta et les oscillations gamma à partir d'une préparation isolée de l'hippocampe entier. Nous décrivons les étapes expérimentales de l'extraction de l'hippocampe aux détails des enregistrements de pince à lames, à l'unité et à l'ensemble des cellules, ainsi qu'à la stimulation optogénétique du rythme theta.

Abstract

Ce protocole décrit les procédures de préparation et d'enregistrement de l'hippocampe entier isolé, des souris WT et transgéniques, ainsi que des améliorations récentes des méthodologies et des applications pour l'étude des oscillations theta. Une caractérisation simple de la préparation isolée de l'hippocampe est présentée dans laquelle la relation entre les oscillateurs internes de l'thetape de l'hippocampe est examinée conjointement avec l'activité des cellules pyramidales et les interneurones GABAergiques, des domaines cornu ammonis-1 (CA1) et sous -ulum (SUB). Dans l'ensemble, nous montrons que l'hippocampe isolé est capable de générer des oscillations theta intrinsèques in vitro et que la rythmicité générée dans l'hippocampe peut être manipulée avec précision par la stimulation optogénétique des interneurones positives à la parvalbumine (PV). La préparation in vitro isolée de l'hippocampe offre une occasion unique d'utiliser simultanément des enregistrements de pince-plaie intracellulaires et champêtres à partir d'un neu visuellement identifiéAfin de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la génération du rythme theta.

Introduction

Les oscillations de l'hippocampal theta (4 à 12 Hz) sont parmi les formes les plus prédominantes d'activité rythmique chez le cerveau mammalien et sont censés jouer un rôle clé dans les fonctions cognitives telles que le traitement de l'information spatio-temporelle et la formation de souvenirs épisodiques ^{1 , 2 , 3} . Alors que plusieurs études in vivo qui mettent en évidence la relation des cellules place-modulées avec des études de navigation spatiale et des lésions, ainsi que des preuves cliniques, étayent la vision selon laquelle les oscillations de ....

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées selon les protocoles et les lignes directrices approuvés par le Comité des soins animaux de l'Université McGill et le Conseil canadien sur les soins des animaux.

1. Préparation inactive de l' hippocampe aiguë

REMARQUE: l'isolement de la préparation intacte de l'hippocampe comprend trois étapes majeures: (1) Préparation des solutions et du matériel, (2) Dissection de l'hippocampe et (3) Mise en place du système de vitesse de perfusion rapide nécessaire à la génération d'oscillations intrinsèques Theta. Dans ce protocole, l'exécution en ....

Results

Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en étudiant les oscillations theta dans la préparation d'hippocampe isolée sur la souris in vitro . La procédure de dissection pour extraire l'hippocampe isolé est illustrée à la figure 1 . En utilisant cette préparation, les oscillations theta intrinsèques peuvent être examinées pendant le placement de plusieurs électrodes de champ, enregistrant l'activité globale et les entr.......

Discussion

Bien que les enregistrements électrophysiologiques à partir de tranches d'hippocampe aiguë constituent une technique standard in vitro , les méthodes présentées ici diffèrent sensiblement de l'approche classique. Contrairement aux préparations en tranche mince où des couches cellulaires spécifiques sont visibles à la surface et peuvent être examinées directement, les préparations intactes d'hippocampe sont plus proches des configurations in vivo où les électrodes sont abaissées dan.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactifs <>forts
Chlorure de sodium	Sigma Aldrich	S9625
Saccharose	Sigma Aldrich	S9378
Bicarbonate de sodium	Sigma Aldrich	S5761
NaH2PO4 - phosphate de sodium monobasique	Sigma Aldrich	S8282
Sulfate de magnésium	Sigma Aldrich	M7506
Chlorure de potassium	Sigma Aldrich	P3911
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7528
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma Aldrich	C5080
Ascorbate de sodium	Sigma Aldrich	A7631-25G
Nom	Company	Numéro de catalogue	Comments
Equipment
Standard Dissecting Ciseaux	Fisher Scientific	08-951-25	Extraction du cerveau
Scalpel Manche #4, 14 cm	WPI	500237	extraction du cerveau
Filter pinces, mâchoires plates, droites (11 cm)	WPI	500456	extraction de cerveau
Paragon Lames de scalpel en acier inoxydable #20	Ultident	02-90010-20	extraction de cerveau
Ciseaux de dissection incurvés à pointe fine	Thermo Fisher Scientific	711999	de cerveau
Téflon (PTFE) -spatule fine recouverte de téflon VWR		82027-534	préparation de l’hippocampe
Hayman Style Microspatule	Fisher Scientific	21-401-25A	préparation hippocampique
Cuillère de laboratoire	Fisher Scientific	14-375-20	préparation hippocampique
Verre borosilicaté Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A	préparation hippocampique
Droper	Fisher Scientific		préparation hippocampique
Lames de rasoir à simple tranchant	VWR	55411-055	préparation de l’hippocampe
Papier pour lentilles (4 x 6")	VWR	52846-001	préparation de l’hippocampe
Boîtes de Pétri en verre (100 x 20 mm)	VWR	25354-080	préparation de l’hippocampe
Plateau en plastique pour la glace ; taille 30 x 20 x 5 cm	n.a.n.a.préparation		l’hippocampe
Solution unique en ligne Chauffage	Warner Instruments	Système de perfusion SH-27B
Pierres à air d’aquarium pour bouillonnement	n.a.n.a.système		de perfusion
Tygon E-3603 tube (ID 1/16 OD 1/8)	Fisherbrand	14-171-129	système de perfusion
poêle électrique	Noir & Système	perfusion	n.a.
95 % O2/5 % CO2 mélange gazeux (carbogène)  ;	Système de perfusion	Vitalaire	SG466204A
Flacons/flacons en verre (4 x 1 L)	n.a.n.a.système	de	perfusion
Chambre d’enregistrement immergée	conception personnalisée (FM)	n.a.Une	alternative commerciale peut être utilisée
Pipettes en verre (1,5/0,84 OD/ID (mm) )	WPI	1B150F-4	électrophysiologie
Hum Bug 50/60 Hz Éliminateur de bruit	Quest Scientific	Q-Humbug	électrophysiologie
Multiclamp 700B amplificateur patch-clamp	Dispositifs moléculaires	Électrophysiologie	MULTICLAMP
Multiclamp 700B Commander Program	Appareils moléculaires	MULTICLAMP	électrophysiologie
Convertisseur numérique/analogique Dispositifs	moléculaires	DDI440	électrophysiologie
PCLAMP10	Dispositifs moléculaires	PCLAMP10	électrophysiologie
Table d’isolation des vibrations  ;	Newport	n.a.electrophysiologie
Micromanipulateurs (à commande manuelle)	Siskiyou  ;	MX130	électrophysiologie (LFP)
Micromanipulateurs (automatisés)	Siskiyou  ;	MC1000e	électrophysiologie (patch)
Moniteur audio  ;	A-M Systems	Modèle 3300	Électrophysiologie
Micropipette/Patch Extracteur de pipette	Sutter	P-97	Électrophysiologie
Microscope à fluorescence vertical sur mesure	Siskiyou	n.a.Imaging
Caméra vidéo analogique	COHU	4912-2000/0000	Imagerie
Acquisition d’images numérique avec logiciel d’imagerie	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	Imagerie
Objectif Olympus 2.5X	Imagerie	Olympus MPLFLN	Imagerie
Objectif à immersion dans l’eau Olympus 40X Olympus		UIS2 LUMPLFLN	Imaging
Système de diodes électroluminescentes (LED) sur mesure  ;	stimulation	n.a.	(Amhilon et al., 2015)
Name	Company	Catalog Number	>Comments
Animals
PV ::Cre (KI) mice	Jackson Laboratory	stock number 008069	Autoriser  ; Expression génique dirigée par Cre dans les interneurones PV
Souris Ai9 constitutive-conditionnelle (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))Numéro de	Jackson Laboratory	007905	Express TdTomato après recombinaison médiée par Cre
Souris Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	de stock du	Jackson Laboratory	Exprimer la protéine de fusion channelrhodopsine-2/EYFP améliorée suite à une exposition à Cre souris PVChY recombinase
	En maison d’élevage	n.a.Progéniture	obtenue par croisement de la lignée PV-Cre avec des souris Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP