Tuning in der Hippocampal Theta Band<em> In vitro</em>: Methoden für die Aufnahme aus dem isolierten Nagetier Septohippocampal Circuit
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Aufzeichnung von rhythmischen neuronalen Netzwerk-Theta und Gamma-Oszillationen aus einer isolierten ganzen Hippocampus-Präparation. Wir beschreiben die experimentellen Schritte von der Extraktion des Hippocampus bis hin zu Details der Feld-, Einheits- und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen sowie der optogenetischen Stimulation des Theta-Rhythmus.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Vorbereitung und Aufzeichnung aus dem isolierten ganzen Hippocampus, von WT und transgenen Mäusen, zusammen mit den jüngsten Verbesserungen in Methoden und Anwendungen für das Studium der Theta-Oszillationen. Es wird eine einfache Charakterisierung des isolierten Hippocampuspräparates vorgestellt, wobei die Beziehung zwischen internen hippocampalen Theta-Oszillatoren zusammen mit der Aktivität von Pyramidenzellen und GABAergischen Interneuronen der Cornu-Ammoni-1 (CA1) und Subiculum (SUB) -Flächen untersucht wird. Insgesamt zeigen wir, dass der isolierte Hippocampus in der Lage ist, intrinsische Theta-Oszillationen in vitro zu erzeugen, und die innerhalb des Hippocampus erzeugte Rhythmizität kann durch optogenetische Stimulation von parvalbumin-positiven (PV) Interneuronen präzise manipuliert werden. Die in vitro isolierte Hippocampuspräparation bietet eine einmalige Gelegenheit, simultane Feld- und intrazelluläre Patch-Clamp-Aufnahmen von visuell identifiziertem neu zu verwendenRons, um die Mechanismen zu verstehen, die der Theta-Rhythmus-Generation zugrunde liegen.
Introduction
Hippocampale Theta-Oszillationen (4 – 12 Hz) gehören zu den vorherrschenden Formen der rhythmischen Aktivität im Säugetiergehirn und werden geglaubt, um Schlüsselrollen in kognitiven Funktionen wie die Verarbeitung von räumlich-zeitlichen Informationen und die Bildung episodischer Erinnerungen 1 , 2 , 3 zu spielen . Während mehrere In-vivo- Studien, die das Verhältnis von theta-modulierten Ort-Zellen mit räumlichen Navigations- und Läsionsstudien hervorheben, sowie klinische Evidenz unterstützen die Ansicht, dass hippocampale Theta-Oszillationen in die Gedächtnisbildung 4 , 5 , 6 involviert sind, Mit der Erzeugung von hippocampalen Theta-Oszillationen sind noch nicht vollständig verstanden In frühen In-vivo- Untersuchungen wurde vorgeschlagen, dass die Theta-Aktivität hauptsächlich von extrinsischen Oszillatoren, insbesondere rhythmischen Inputs, abhingVon afferenten Hirnstrukturen wie dem Septum und dem entorhinalen Kortex 7 , 8 , 9 , 10 . Eine Rolle für intrinsische Faktoren – interne Konnektivität von hippocampalen neuronalen Netzwerken zusammen mit den Eigenschaften von Hippocampusneuronen – wurde auch auf der Basis von in vitro Beobachtungen 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 postuliert. Abgesehen von einigen Landmarkstudien 19 , 20 , 21 sind jedoch Schwierigkeiten bei der Entwicklung von Ansätzen, die physiologisch realistische Populationsaktivitäten in einer einfachen In-vitro- Schichtvorbereitung replizieren könntenS hat seit langem eine detailliertere experimentelle Untersuchung der intrinsischen Fähigkeiten des Hippocampus und der verwandten Gebiete zur Selbst-Erzeugung von Theta-Schwingungen verzögert.
Ein wichtiger Nachteil der Standard- In-vitro- Dünnschicht-Versuchsanpassung ist, dass die 3D-zelluläre und synaptische Organisation von Hirnstrukturen in der Regel kompromittiert wird. Dies bedeutet, dass viele Formen von konzertierten Netzwerkaktivitäten, die auf räumlich verteilten Zellanordnungen basieren, von lokalisierten Gruppen (≤1 mm Radius) bis hin zu Populationen von Neuronen, die sich über ein oder mehrere Gehirnbereiche (> 1 mm) erstrecken, nicht unterstützt werden können. Angesichts dieser Überlegungen war eine andere Art von Ansatz erforderlich, um zu untersuchen, wie Theta-Oszillationen im Hippocampus entstehen und sich auf verwandte kortikale und subkortikale Ausgangsstrukturen ausbreiten.
In den letzten Jahren wurde die anfängliche Entwicklung der "kompletten septo-hippocampalen" Präparation zur bidirektionalen Intera untersuchtCtions der beiden Strukturen 22 und die anschließende Evolution der "isolierten Hippocampus" -Präparation haben ergeben, dass intrinsische Theta-Oszillationen spontan im Hippocampus ohne externe rhythmische Input 23 auftreten . Der Wert dieser Ansätze liegt in der ersten Einsicht, dass die gesamte funktionale Struktur dieser Regionen bewahrt werden musste, um als ein Theta-Rhythmus-Generator in vitro zu funktionieren 22 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Während elektrophysiologische Aufnahmen von akuten Hippocampusscheiben eine Standard- In-vitro- Technik darstellen, unterscheiden sich die hier vorgestellten Methoden erheblich vom klassischen Ansatz. Anders als die dünnen Scheibenpräparate, bei denen spezifische Zellschichten an der Oberfläche sichtbar sind und direkt untersucht werden können, sind die intakten Hippocampuspräparate eher in in vivo- Konfigurationen verwandt, bei denen Elektroden in gezielte Hirnregionen abgesenkt werden,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den kanadischen Instituten für Gesundheitsforschung und Naturwissenschaften unterstützt.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
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