Tuning nella Banda Theta Ippocampale<em> In vitro</em>: Metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore Septohippocampal
Summary
Qui presentiamo un protocollo per registrare la teoria ritmica della rete neuronale e le oscillazioni gamma da una preparazione interamente isolata di ippocampo. Descriviamo le fasi sperimentali dall'estrazione dell'ippocampo ai dettagli del campo, delle registrazioni a blocchi di patch patch unitari e intere cellule, nonché della stimolazione ottogenetica del ritmo theta.
Abstract
Questo protocollo descrive le procedure per la preparazione e la registrazione dall'ippocampo intero isolato, dai topi transgenici e dai topi transgenici, nonché dai recenti miglioramenti nelle metodologie e nelle applicazioni per lo studio delle oscillazioni. Viene presentata una semplice caratterizzazione della preparazione ippocampale isolata, in cui viene analizzata la relazione tra oscillatori ippocampali theta e l'attività delle cellule piramidali e degli interneuroni GABAergici delle aree cornu ammonis-1 (CA1) e subiculum (SUB). Nel complesso mostriamo che l'ippocampo isolato è in grado di generare oscillazioni di theta intrinseche in vitro e che la ritmicità generata all'interno dell'ippocampo può essere manipolata in modo preciso dalla stimolazione ottogenetica di interneuroni parvalbuminici (PV). Il preparato ippocampo isolato in vitro offre un'occasione unica per utilizzare registrazioni simultanee di campo e intracellulari da un patch-clamp da identificazioni visivamente identificatePer capire meglio i meccanismi che sottendono alla generazione del ritmo theta.
Introduction
Le oscillazioni di theta ippocampali (4-12 Hz) sono tra le forme più prevalenti di attività ritmica nel cervello dei mammiferi e si credono a svolgere ruoli chiave nelle funzioni cognitive quali elaborazione di informazioni spaziali e formazione di memorie episodiche 1 , 2 , 3 . Mentre diversi studi in vivo che evidenziano il rapporto delle cellule place-theta modulate con studi di navigazione spaziale e lesioni, nonché prove cliniche, supportano la visione che le oscillazioni ippocampali sono coinvolte nella formazione della memoria 4 , 5 , 6 , i meccanismi associati Con generazione di oscillazioni theta ippocampali non sono ancora completamente compresi. Le prime indagini in vivo suggerivano che l'attività theta dipendesse principalmente da oscillatori estrinseci, in particolare l'ingresso ritmicoDa strutture cerebrali afferenti come il settto e la corteccia entorhina 7 , 8 , 9 , 10 . È stato anche postulato un ruolo per fattori intrinseci – connettività interna delle reti neuronali ippocampali insieme alle proprietà dei neuroni ippocampali – in base alle osservazioni in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Tuttavia, a parte alcuni studi di rilievo 19 , 20 , 21 , difficoltà nello sviluppo di approcci che potrebbero replicare attività fisiologicamente realistiche di popolazione in una semplice preparazione di fetta in vitroSono stati, per lungo tempo, ritardato un esame sperimentale più dettagliato delle abilità intrinseche dell'ippocampo e delle aree correlate per auto generare oscillazioni di theta.
Un importante inconveniente dell'insieme sperimentale in vitro di sottile fetta è che l'organizzazione cellulare e sinaptica 3D delle strutture cerebrali è di solito compromessa. Ciò significa che non possono essere supportate molte forme di attività di rete concertata basate su gruppi di cellule distribuite spazialmente, che vanno da gruppi localizzati (≤1 mm radius) alle popolazioni di neuroni diffusi in una o più aree del cervello (> 1 mm). Tenuto conto di queste considerazioni, è stato necessario un approccio diverso per studiare come le oscillazioni di theta emergono nell'ippocampo e si propagino alle strutture di uscita corticali e subcorticali correlate.
Negli ultimi anni, lo sviluppo iniziale della preparazione completa "septo-ippocampale" per esaminare l'intero bidirezionaleLe due delle strutture 22 e la conseguente evoluzione della preparazione "ippocampo isolato" hanno rivelato che le oscillazioni di theta intrinseca si verificano spontaneamente nell'ippocampo privo di input ritmico esterno 23 . Il valore di questi approcci risiede sulla prima comprensione che tutta la struttura funzionale di queste regioni doveva essere conservata per poter funzionare come un ritmo di theta in vitro 22 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre le registrazioni elettrofisiologiche da fette acute di ippocampo costituiscono una tecnica standard in vitro , i metodi presentati qui differiscono sostanzialmente dal metodo classico. A differenza delle preparazioni sottili di fetta dove sono visibili strati cellulari specifici sulla superficie e possono essere esaminati direttamente, i preparati ippocampali intatti sono più simili alle configurazioni in vivo in cui gli elettrodi vengono abbassati in regioni cerebrali mirate attraversando sing…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dagli Istituti Canadesi di Salute e Scienze Naturali.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
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