海馬シータバンドのチューニング<em>インビトロ</em>：隔離されたげっ歯類胸腺腫回路からの記録方法
Summary
ここでは、分離された全海馬調製物からのリズミカルなニューロンネットワークのシータおよびガンマ振動を記録するためのプロトコルを提示する。我々は、海馬の抽出からフィールド、ユニタリーおよび全細胞のパッチクランプ記録ならびにテータリズムの光発生ペーシングの詳細までの実験ステップを記載する。
Abstract
このプロトコールは、WTおよびトランスジェニックマウスの単離された全海馬からの調製および記録のための手順、ならびにシータ振動の研究のための最近の方法論および適用の概要を概説する。単離された海馬調製物の簡単な特徴付けが提示され、それにより、角膜アンモニア-1（CA1）および漿膜（SUB）領域のピラミッド細胞およびGABA作動性介在ニューロンの活性とともに、内部海馬θオシレータ間の関係が調べられる。全体的に、本発明者らは、単離された海馬がインビトロで固有のシータ振動を生成することができ、海馬内で生成されたリズムが、パルブアルブミン陽性（PV）介在ニューロンの光発生刺激によって正確に操作され得ることを示す。 インビトロで単離された海馬調製物は、視覚的に同定されたneuからの同時のフィールドおよび細胞内パッチクランプ記録を使用する独特の機会を提供するシータ・リズムの生成メカニズムの理解を深めています。
Introduction
海馬のシータ振動（4から12 Hz）は哺乳動物の脳におけるリズム活性の最も優勢な形態の中で、そのようなエピソードメモリ1、2、3の時空間情報及び形成の処理として、認知機能に重要な役割を果たしていると考えられています。空間ナビゲーションと病変の研究、ならびに臨床的証拠を有するシータ変調場所細胞の関係を強調いくつかのin vivo研究は、海馬のシータ振動が記憶形成4、5、6、関連するメカニズムに関与しているという見解を支持しながら海馬の生成は、まだ完全に理解されていない。初期のインビボでの研究では、シータ活性は主として外因性オシレータ、特にリズム入力に依存していることが示唆された求心性脳構造から、このような隔壁及び嗅内皮質7、8、9、10として。一緒に海馬ニューロンの特性を有する海馬ニューラルネットワークの内部接続- -内因性因子の役割はまた、in vitroの観察11、12、13、14、15、16、17、18に基づいて仮定されました。しかし、離れていくつかの画期的な研究19、20、21、 体外スライス標本でシンプルに生理的に現実的な人口の活動を複製することができなアプローチを開発する上での困難から長い間、海馬の固有の能力および関連領域のより詳細な実験的検討が、シータ振動を自己生成するのを遅らせてしまった。
インビトロ薄切片実験の標準的な設定の重要な欠点は、脳構造の3D細胞およびシナプス組織が通常損なわれていることである。これは、局所的なグループ（半径1mm以下）から1つ以上の脳領域（> 1mm）にわたって広がるニューロンの集団に及ぶ、空間的に分布した細胞アセンブリに基づく協調的ネットワーク活動の多くの形態がサポートされないことを意味する。これらの考察を考慮して、シータ振動が海馬でどのように現れ、関連する皮質および皮質下の出力構造に伝播するかを研究するために、異なるタイプのアプローチが必要であった。
近年、双方向性を調べるための「完全なsepto-hippocampal」準備の初期の開発2つの構造22の構造、およびその後の「単離された海馬」調製の進化は、固有のシータ振動が外的な律動的な入力23を欠く海馬において自発的に起こることを明らかにした。これらのアプローチの値は、これらの領域の全体の機能構成は、インビトロ 22 におけるシータリズム発生器として機能するために保存しなければならなかった最初の洞察です。
Protocol
すべての手順は、McGill University Animal Care CommitteeとCanadian Animal Care Councilによって承認されたプロトコールとガイドラインに従って行われています。 1.急性海馬のインビトロ調製注：インタクトな海馬調製物を単離するには、（1）溶液および装置の準備、（2）海馬の解剖および（3）固有のシータ振動の生成に必要な速い灌流速度システムの設定?…
Representative Results
このセクションは、インビトロでマウス単離された海馬調製物におけるシータ振動を研究することによって得られ得る結果の例を説明する。単離された海馬を抽出するための解剖手順を図1に示す 。この準備を使用して、複数のフィールド電極の配置中に固有のシータ振動を検査し、全体的な活動を記録?…
Discussion
急性海馬スライスからの電気生理学的記録は標準的なインビトロ技術を構成するが、ここに提示される方法は従来のアプローチとは実質的に異なる。特定の細胞層が表面で可視であり、直接検査することができる薄いスライス調製物とは異なり、インタクトな海馬調製物は、個々の層を横切って電極を標的脳領域に下ろすインビボ配置にさらに類似している。海馬の完全?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダの健康研究および自然科学研究所によって支援されました。
Materials
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
References
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Citer Cet Article
Manseau, F., Williams, S. Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit. J. Vis. Exp. (126), e55851, doi:10.3791/55851 (2017).