नवजात शिशुओं से स्पाइनल कॉर्ड न्यूरॉन्स अलगाव और संस्कृति
Summary
यह अध्ययन, WT नवजात चूहों से न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है। इसके लिए नियोननल माउस से रीढ़ की हड्डी की सावधान विच्छेदन की आवश्यकता होती है, इसके बाद मैनिकल और एनजीमामैटिक क्लेवेज के जरिए स्पाइनल कॉर्ड ऊतक से न्यूरॉन्स की जुदाई अलग होती है।
Abstract
हम रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स के अलगाव और संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। न्यूरॉन्स नवजात C57BL / 6 चूहों से प्राप्त होते हैं और प्रसवोत्तर दिन 1-3 पर पृथक होते हैं। आमतौर पर एक प्रजनन जोड़ी से पैदा हुए एक माउस कूड़े, एक प्रयोग के लिए इकट्ठे होते हैं, और आईफ़्लुरुनेन के साथ सुन्नत के बाद प्रत्येक माउस से रीढ़ की हड्डी को अलग-अलग एकत्र किया जाता है। स्पाइनल कॉलम को विच्छेदित किया जाता है और फिर रीढ़ की हड्डी को स्तंभ से जारी किया जाता है। रीढ़ की हड्डी की डोरियों को एंजाइमेटिक प्रोटीज के लिए डिलीवरी के सतह क्षेत्र में वृद्धि करने के लिए फिर से बनाया जाता है जो न्यूरॉन्स और अन्य कोशिकाओं को ऊतक से मुक्त होने की अनुमति देता है। उत्परिवर्तन तब कोशिकाओं को समाधान में रिलीज करने के लिए उपयोग किया जाता है बाद में यह समाधान घनत्व ढाल में भिन्न होता है ताकि समाधान में विभिन्न कोशिकाओं को अलग किया जा सके, जिससे न्यूरॉन्स को पृथक किया जा सके। लगभग 1-2.5 x 10 6 न्यूरॉन्स एक कूड़े समूह से पृथक हो सकते हैं। न्यूरॉन्स को चिपकने वाला तथ्य के साथ लेपित कुओं पर लगाया जाता हैआरएस कि उचित विकास और परिपक्वता के लिए अनुमति देते हैं। न्यूरॉन्स विकास और संस्कृति माध्यम में परिपक्वता तक पहुंचने में लगभग 7 दिन का समय लेते हैं और इसके बाद इलाज और विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
स्पाइनल कॉर्ड पैथोलॉजी को समझना, मैक्रोस्कोपी और सूक्ष्म स्तर पर, विभिन्न मॉडलों के उपयोग की आवश्यकता है। रीढ़ की हड्डी की बीमारी और चोट के विवो जांच के लिए बड़े और छोटे पशु मॉडल 1 , 2 , 3 का उपयोग किया जाता है विवो में इन मुद्दों का अध्ययन करते समय इसकी योग्यताएं होती हैं, रीढ़ की हड्डी का विश्लेषण पूरे रीढ़ की हड्डी के समरूप या ऊतक वर्ग 4 तक सीमित है। यह निवासी न्यूरॉन्स और आसपास के ग्लिया में रीढ़ की हड्डी में विशिष्ट प्रतिक्रियाओं और लक्ष्यों को अलग करने की कोशिश करते समय कुछ अस्पष्टता पैदा करता है। आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ चूहों की बढ़ती उपलब्धता से सेलुलर और आणविक स्तरों पर जीव विज्ञान की अधिक विस्तृत जांच की अनुमति मिलती है। इस प्रकार, एक नवजात माउस मॉडल का उपयोग यहां किया जाता है, जो इन विट्रो में रीढ़ की हड्डी के न्यूरॉन्स के अद्वितीय गुणों और जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अनुमति देता है।
एंट "> इन विट्रो में न्यूरॉन्स के अलगाव और रखरखाव विशेष रूप से सीधा नहीं है। वयस्क कृन्तकों के कॉर्टिकल टिशू से न्यूरॉन अलगाव के लिए तकनीकों का रिश्तेदार बहुतायत है, जो अलग-अलग न्यूरॉन्स ( यानी लाखों) की पर्याप्त संख्या में प्रतीत होते हैं 5 , 6 , 7. इसके विपरीत, ऊतक के छोटे द्रव्यमान के कारण रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से न्यूरॉन्स की मात्रा 8 , 9 , 10 कम है। इसके अलावा, चूहों में, नवजात के अलगाव के लिए तकनीकों का एक सापेक्ष कमी है रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स, और मौजूदा तरीकों को कम न्यूरॉन पैदावार ( यानी सैकड़ों) 9 या श्रमसाध्य और संसाधन-भारी तकनीकों से भ्रूणीय चूहों 10 के अलगाव की आवश्यकता होती है।इस प्रोटोकॉल में, हमएक ऐसी तकनीक का उपयोग करें जो नवजात शिशुओं के रीढ़ की हड्डी से मूल्य की पर्याप्त मात्रा में न्यूरॉन्स की लागत-और संसाधन-प्रभावी अलगाव के लिए अनुमति देता है। जैसा कि पहले प्रकाशित तकनीकों में सामान्य है, हम पापीन को एंजाइमेटिक प्रोटेज़ के रूप में उपयोग करते हैं, जो रीढ़ की हड्डी के ऊतक 5 , 6 से न्यूरॉन्स की रिहाई के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, हम परिष्कृत सेल अलगाव के लिए एक घनत्व ढाल का उपयोग करते हैं, जो पहले 6 , 10 प्रभावी होने के लिए दिखाया गया है। जबकि माध्यमों में कोशिकाएं incubated हैं हमारे अनुभव में और पहले से 11 प्रकाशित हो सकते हैं, जबकि ताजा B27 संस्कृति माध्यम पूरक के साथ पूरकता न्यूरॉन दीर्घायु के लिए महत्वपूर्ण साबित हुआ है। न्यूरॉन्स आम तौर पर 10 दिनों के लिए व्यवहार्य होते हैं, जिससे उपचार के लिए अनुमति दी जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह तकनीक रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स की विश्वसनीय संस्कृति के लिए अनुमति देता है। तकनीक में प्रवीणता हासिल होने के बाद, इसे पूरा करने के लिए लगभग 3.5 घंटे लगते हैं। हम लगभग 4 घंटे में 2 अलग-अलग लिटर (16 चूहों कुल) ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के पास कोई स्वीकार नहीं है।
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
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