Ryggmärgsneurons isolering och kultur från neonatala möss
Summary
Denna studie presenterar en teknik för isolering av neuroner från WT-neonatala möss. Det kräver noggrann dissektion av ryggmärgen från neonatalmusen, följt av separering av neuroner från ryggmärgsvävnaden genom mekanisk och enzymatisk klyvning.
Abstract
Vi presenterar ett protokoll för isolering och kultur av ryggmärgsneuroner. Neuronerna erhålls från neonatal C57BL / 6 möss och isoleras på postnatal dag 1-3. En muskull, vanligtvis 4-10 valpar födda från ett avelspar, samlas in för ett försök, och ryggraden samlas individuellt från varje mus efter eutanasi med isofluran. Ryggraden dissekeras och sedan frigörs ryggmärgen från kolonnen. Spinalkablarna mals sedan för att öka ytan av leverans för ett enzymatiskt proteas som tillåter att neuronerna och andra celler frigörs från vävnaden. Trituration används sedan för att frigöra cellerna i lösning. Denna lösning fraktioneras därefter i en densitetsgradient för separation av de olika cellerna i lösning, vilket möjliggör för neuroner att isoleras. Cirka 1-2,5 x 106 neuroner kan isoleras från en kullgrupp. Neuronerna utsöndras sedan på brunnar belagda med adhesiv factoRs som möjliggör riktig tillväxt och mognad. Neuronerna tar cirka 7 dagar för att nå mognad i tillväxt och odlingsmedium och kan därefter användas för behandling och analys.
Introduction
Förståelse av ryggmärgspatologi kräver användning av olika modeller, både på makroskopiska och mikroskopiska nivåer. Stora och små djurmodeller 1 , 2 , 3 används för in vivo undersökningar av ryggmärgs sjukdom och skada. Samtidigt som man studerar dessa problem in vivo har dess fördelar är analys av ryggmärgen begränsad till hela ryggmärgshomogenatet eller till vävnadssektionerna 4 . Detta skapar viss tvetydighet när man försöker isolera specifika svar och mål i ryggmärgen bland sina inhemska neuroner och omgivande glia. Den ökande tillgängligheten av genetiskt manipulerade möss möjliggör mer detaljerade undersökningar av biologin vid cellulära och molekylära nivåer. Således används en nyfödd musmodell här, vilket möjliggör studier av de unika egenskaperna och biologin hos ryggmärgsneuroner in vitro .
Ent "> Isolering och underhåll av neuroner in vitro är inte särskilt okomplicerat. Det finns ett relativt överflöd av tekniker för neuronisolering från den kortikala vävnaden hos vuxna gnagare som verkar resultera i ett betydande antal isolerade neuroner ( dvs miljoner) 5 , 6 , 7. I motsats härtill är utbytet av neuroner från ryggmärgsvävnad lägre 8 , 9 , 10 , delvis på grund av den mindre vävnadsmassan. Dessutom är det hos mus en relativ paucitet av tekniker för isolering av neonatal Ryggmärgsneuroner, och befintliga metoder begränsas av lägre neuronutbyten ( dvs. hundratals) 9 eller mödosamma och resurs-tunga tekniker som kräver isolering av embryonala möss 10 .I detta protokoll, viAnvänd en teknik som möjliggör kostnad och resurseffektiv isolering av ett väsentligt antal neuroner från ryggmärgen hos neonatala möss. Som är vanligt vid tidigare publicerade tekniker använder vi papain som ett enzymatiskt proteas, vilket möjliggör frisättning av neuroner från ryggmärgsvävnaden 5 , 6 . Dessutom använder vi en densitetsgradient för raffinerad cellskillnad, som tidigare visat sig vara effektiv 6 , 10 . Medan mediet där cellerna inkuberas kan variera, enligt vår erfarenhet och som tidigare publicerad 11 , har tillskott med färskt B27 odlingsmediumtillskott visat sig vara avgörande för neuronlängden. Neuronerna är vanligtvis livskraftiga i upp till 10 dagar, vilket möjliggör behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna teknik möjliggör tillförlitlig odling av ryggmärgsneuroner. När kunskaper i tekniken uppnåtts tar det ungefär 3,5 timmar att slutföra. Vi har kunnat genomföra isoleringen av neuroner från 2 separata kullar (16 mus totalt) på ca 4 h. Det viktigaste steget i genomförbarhet är att på ett skickligt sätt kunna extrahera ryggmärgen från mössen. Utbytet möjliggör plätering av flera brunnar och för förmågan att testa neuronerna under olika betingelser. Vi har kunnat behandla neuronerna efter mognad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
