Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü
Summary
Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir.
Abstract
Spinal kord nöronlarının izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunmaktayız. Nöronlar yenidoğan C57BL / 6 farelerinden elde edilir ve 1-3 doğum sonrası izole edilir. Bir fare çöpü, genellikle bir üreme çiftinden doğan 4-10 yavru, bir deney için toplanır ve izofluran ile ötenazi yapıldıktan sonra omurilik kordları her fareden ayrı ayrı toplanır. Spinal kol disseke edilir ve omurilik o kolondan salınır. Omurga kordonları nöronların ve diğer hücrelerin dokudan salınmasına izin veren bir enzimatik proteaz için teslimat yüzey alanını arttırmak üzere kıyılır. Tritürasyon daha sonra hücreleri çözeltiye boşaltmak için kullanılır. Bu çözelti, daha sonra, nöronların izole edilmesine olanak tanıyan, çözeltideki çeşitli hücreleri ayırmak için bir yoğunluk derecesinde fraksiyon haline getirilir. Bir çöp grubundan yaklaşık 1-2.5 x 106 nöron izole edilebilir. Nöronlar daha sonra yapışkanlı fiillerle kaplanmış oyukların üzerine serilirUygun gelişme ve olgunlaşma için izin verilen rs. Nöronlar büyüme ve kültür ortamında olgunluğa erişmek için yaklaşık 7 gün alır ve bundan sonra tedavi ve analiz için kullanılabilir.
Introduction
Spinal kord patolojisini anlamak, makroskopik ve mikroskobik seviyelerde çeşitli modellerin kullanılmasını gerektirir. Büyük ve küçük hayvan modelleri 1 , 2 , 3 spinal kord hastalığının ve yaralanmasının in vivo araştırmalarında kullanılır. Bu sorunların in vivo incelenmesi esastır ancak omurilik analizi, tüm omurilik homojenatı veya doku kesitleri 4 ile sınırlıdır. Bu, var olan nöronlar ve çevresindeki glialar arasında omurilikteki spesifik tepkileri ve hedefleri ayırmaya çalışırken bazı belirsizlik yaratır. Genetik olarak manipüle edilmiş farelerin artan miktarda bulunması, biyolojinin hücresel ve moleküler seviyelerde daha ayrıntılı araştırılmasına olanak tanır. Böylece, in vitro omurilik nöronlarının benzersiz özelliklerini ve biyolojisini incelemek için, burada neonatal bir fare modeli kullanılır.
In vitro olarak nöronların izolasyonu ve bakımı özellikle net değildir Yetişkin kemirgenlerin korteks dokusundan nöron tecrit teknikleriyle nispeten bol miktarda izole nöron ( yani milyonlarca) elde edilmesi beklenir , 6 , 7. Bunun aksine, omurilik dokusundan alınan nöronların verimi, daha az doku kütlesi nedeniyle kısmen 8 , 9 , 10'dur . Ayrıca, farelerde, yenidoğanın izolasyonu için teknikler göreceli olarak az sayıdadır Omurilik nöronları ve mevcut yöntemler, daha düşük nöron verimleri (yüzlerce) veya embriyonik farelerin izolasyonunu gerektiren zahmetli ve ağır kaynaklı tekniklerle sınırlıdır 10 .Bu protokolde,Yenidoğan farelerinin spinal kordlarından önemli miktarda nöronun maliyet ve kaynak etkili bir şekilde izole edilmesini sağlayan bir teknik kullanın. Daha önce yayınlanan tekniklerde yaygın olarak görüldüğü gibi papain enzimatik bir proteaz olarak kullanılmaktadır ve 5 , 6 omurilik dokusundan nöronların salınmasına izin vermektedir. Ek olarak, rafine edilmiş hücre ayrıştırması için daha önce etkili olduğu 6,10 olduğu gösterilen yoğunluk derecesini kullanıyoruz. Hücrelerin inkübe edildiği ortam tecrübemiz ve daha önce yayınlanan 11'de farklılık gösterse de, taze B27 kültürü takviyesi takviyesi, nöron ömrü için kritik olduğu kanıtlanmıştır. Nöronlar, tipik olarak, tedavinin yapılmasına olanak tanıyan 10 gün boyunca uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu teknik, omurilik nöronlarının güvenilir bir şekilde kültürlenmesine izin verir. Teknik yeterlilik elde edildiğinde, tamamlanması yaklaşık 3,5 saat sürer. Nöronların izolasyonunu, yaklaşık 4 saat içinde 2 ayrı çöpten (toplam 16 fare) gerçekleştirebildik. Fizibilitedeki ana adım, omurilik kablolarını farelerden ayıklamaktır. Verim, çeşitli kuyucukların kaplanmasına ve çeşitli koşullar altında nöronların test edilmesine imkan verir. Olgunlaşma sonrasındaki nöronları tedavi edebil…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarların onayları yok.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
