Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.
Abstract
Infektiöse cDNA-Klone erlauben die genetische Manipulation eines Virus und erleichtern so die Arbeit an Impfstoffen, Pathogenese, Replikation, Übertragung und Virusentwicklung. Hier beschreiben wir den Aufbau eines infektiösen Klons für Zika Virus (ZIKV), der derzeit einen explosiven Ausbruch in Nord- und Südamerika verursacht. Um Toxizität gegenüber Bakterien zu verhindern, die häufig mit Flavivirus-abgeleiteten Plasmiden beobachtet wird, erzeugten wir ein Zwei-Plasmid-System, das das Genom am NS1-Gen trennt und stabiler ist als Volllängen-Konstrukte, die ohne Mutationen nicht erfolgreich gewonnen werden konnten. Nach der Verdauung und Ligation, um die beiden Fragmente zu verbinden, kann eine Volllängen-Virus-RNA durch in vitro- Transkription mit T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. Nach der Elektroporation von transkribierter RNA in Zellen wurde das Virus gewonnen, das ähnliche In-vitro- Wachstumskinetiken und In-vivo- Virulenz- und Infektions-Phänotypen in Mäusen und Mücken zeigte.
Introduction
Zika-Virus (ZIKV, Familie Flaviviridae : Gattung Flavivirus ) ist ein Moskito-getragenes Flavivirus, das in Brasilien in den Jahren 2013-14 angekommen ist und anschließend mit einem massiven Ausbruch der fiebrigen Krankheit verbunden war, die sich in ganz Amerika verbreitete 1 . Darüber hinaus wurde ZIKV mit schwerwiegenden Erkrankungen wie dem Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen und Mikrozephalie bei Föten und Neugeborenen verknüpft 2 . Wenig war über ZIKV vor seiner schnellen Verbreitung in der westlichen Hemisphäre bekannt. Dazu gehört ein Mangel an molekularen Werkzeugen, was die mechanistische Forschung behindert. Molekulare Werkzeuge für Viren, wie infektiöse cDNA-Klone, erleichtern die Impfung und die antivirale therapeutische Entwicklung und ermöglichen die Bewertung von viralen genetischen Faktoren, die mit der differentiellen viralen Pathogenese, der Immunantwort und der viralen Evolution zusammenhängen.
Flavivirus-infektiöse Klone sind bekannt, dass sie in Bakterien aufgrund von cr stark instabil sindYptische prokaryotische Promotoren, die in ihren Genomen vorhanden sind 3 . Es wurden mehrere Ansätze verwendet, um dieses Problem zu lindern; Einschließlich der Insertion von Tandemwiederholungen stromaufwärts von viralen Sequenzen 4 , Mutation von mutmaßlichen prokaryotischen Promotorsequenzen 5 , Aufteilen des Genoms in mehrere Plasmide 6 , Vektoren mit niedriger Kopienzahl (einschließlich bakterieller künstlicher Chromosomen) 7 , 8 und Insertion von Introns im viralen Genom 9 . Ein einseitiges System ohne Modifikationen wurde für ZIKV beschrieben; Dieser Klon schien jedoch in der Zellkultur und bei den Mäusen 10 zu dämpfen. Andere Gruppen haben Introns in das ZIKV-Genom konstruiert, was eine Störung von instabilen Sequenzen in Bakterien ermöglicht, die in Säugetierzellen in vitro zur Herstellung von infektiösem Virus 11 gespleißt werden können, 12 Zusätzlich wurde ein PCR-basiertes System mit dem Titel Infectious-Subgenomic-Amplicons erfolgreich eingesetzt, um den Prototyp MR766-Stamm von ZIKV 13 zu retten. Der hier beschriebene Ansatz erfordert keine Fremdsequenzen, sondern stört das Genom im Bereich hoher Instabilität durch die Verwendung mehrerer Plasmide, die bisher erfolgreich mit Gelbfieber 6 , Dengue 14 , 15 und West-Nil-Viren 16 verwendet wurden. Darüber hinaus erleichtert die Zugabe der Hepatitis-D-Ribozym-Sequenz an den viralen genomischen Termini die Schaffung eines authentischen 3'-Endes ohne die Notwendigkeit der Addition einer Linearisierungsstelle. Zusätzlich werden beide Plasmide in einem Vektor mit niedriger Kopienzahl (pACYC177, ~ 15 Kopien pro Zelle) konstruiert, um jegliche Resttoxizität 17 zu mildern. Das gewonnene Virus zeigt ein vergleichbares Wachstumsprofil anElterliches Virus in in vitro Wachstumskurven in 8 Zelllinien, die eine Vielzahl von Zelltypen umfassen, die von Säugetieren und Insekten abgeleitet sind, und hat identische pathogene Profile bei Mäusen und Infektions-, Verbreitungs- und Übertragungsraten in den Mücken 18 gezeigt .
Hierin beschreiben wir ein Protokoll, in dem beschrieben wird, wie man die infektiösen Klonplasmide wächst, in vitro eine Volllängen-Virus-RNA (das virale Genom) erzeugt und in der Zellkultur ein infektiöses Virus wiederherstellt. Zuerst beschreiben wir die Ausbreitung von Plasmiden in Bakterien oder bakterienfreien Verstärkung mittels Rollkreisverstärkung (RCA). Als nächstes zeigen wir, wie die beiden Plasmide verdaut werden und dann anschließend miteinander ligiert werden, um ein Volllängenvirus zu erzeugen. Schließlich beschreiben wir die Produktion von transkribierter RNA und deren anschließende Elektroporation in Vero-Zellen, gefolgt von Titration des gewonnenen Virus (Abbildung 1 ). Der beschriebene Ansatz ist schnell, so dass foR Erholung von infektiösen Virusbeständen in 1-2 Wochen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic und Claudia Rückert für ihre Unterstützung bei der Charakterisierung des vom Klon abgeleiteten Virus. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Allergie und Infektionskrankheiten, NIH unter den Stipendien AI114675 (BJG) und AI067380 (GDE) unterstützt.
Materials
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
References
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