Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika
Summary
Questo protocollo descrive il recupero del virus infettivo da Zika da un clone infetto cDNA a due plasmide.
Abstract
I cloni infetti cDNA consentono la manipolazione genetica di un virus, facilitando così il lavoro sui vaccini, la patogenesi, la replicazione, la trasmissione e l'evoluzione virale. Qui descriviamo la costruzione di un clone infettivo per il virus Zika (ZIKV), che attualmente sta causando uno scoppio esplosivo nelle Americhe. Per evitare la tossicità per i batteri che è comunemente osservato con i plasmidi derivati da flavivirus, abbiamo generato un sistema a due plasmidi che separa il genoma al gene NS1 ed è più stabile di quelli a piena lunghezza che non possono essere recuperati con successo senza mutazioni. Dopo la digestione e la legatura per unire i due frammenti, l'RNA virale a piena lunghezza può essere generato mediante trascrizione in vitro con T7 RNA polimerasi. Dopo l'elettroporazione di RNA trascritto nelle cellule, è stato recuperato il virus che ha mostrato simili cinetica di crescita in vitro e fenotipi di virulenza e infezione in vivo nei topi e nelle zanzare rispettivamente.
Introduction
Il virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) è un flavivirus dalle zanzare che è arrivato in Brasile nel 2013-14 ed è stato successivamente associato ad un massiccio focolaio di malattia febbrile che si è diffuso in tutte le Americhe 1 . Inoltre, ZIKV è stato collegato a gravi conseguenze della malattia, come la sindrome di Guillain-Barré negli adulti e la microcefalia nei feti e nei neonati 2 . Poco noto su ZIKV prima della sua diffusione rapida nell'emisfero occidentale. Ciò comprendeva la mancanza di strumenti molecolari, ostacolando così la ricerca meccanicistica. Gli strumenti molecolari per i virus, come i cloni infetti cDNA, facilitano il vaccino e lo sviluppo terapeutico antivirale e consentono la valutazione dei fattori genetici virali correlati alla patogenesi virale differenziale, alla risposta immunitaria e all'evoluzione virale.
I cloni infettivi di Flavivirus sono noti per essere altamente instabili nei batteri dovuti alla crI promotori prokaryotici yptici presenti nei loro genomi 3 . Sono stati utilizzati diversi approcci per migliorare questo problema; Incluso l'inserimento di ripetizioni tandem a monte delle sequenze virali 4 , la mutazione di sequenze 5 di promoter prokaryotiche presunte, suddividendo il genoma in plasmidi multipli 6 , vettori di numeri a bassa copia (compresi i cromosomi artificiali batterici) 7 , 8 e l'inserimento di introni nel genoma virale 9 . Un sistema a tutta lunghezza senza modifiche è stato descritto per ZIKV; Tuttavia, questo clone sembrava essere attenuato nella coltura cellulare e nei topi 10 . Altri gruppi hanno introdotto gli introni nel genoma ZIKV, consentendo la distruzione di sequenze instabili nei batteri che possono essere splicate in cellule di mammiferi in vitro per la produzione di virus infettivo 11, 12 . Inoltre, un sistema basato su PCR intitolato Infectious-Subgenomic-Amplicons è stato usato con successo per salvare il prototipo MR766 ceppo di ZIKV 13 . L'approccio qui descritto non richiede sequenze straniere, ma disturba il genoma nella regione di elevata instabilità usando plasmidi multipli, precedentemente impiegati con successo con la febbre gialla 6 , i dengue 14 , 15 e i virus del West Nile 16 . Inoltre, l'aggiunta della sequenza ribozima di epatite D alle terminazioni genomiche virali facilita la creazione di un'autentica 3 'estremità senza la necessità di aggiungere un sito di linearizzazione. Inoltre, entrambi i plasmidi sono costruiti in un vettore di numero di copie basse (pACYC177, ~ 15 copie per cellula) per mitigare ogni tossicità residua 17 . Il virus recuperato mostra un profilo di crescita comparabile aVirus parenterale in curve di crescita in vitro in 8 linee cellulari comprendenti una varietà di tipi di cellule derivanti da entrambi i mammiferi e dagli insetti e ha mostrato identici profili patogeni nei topi e nelle infezioni, diffusione e velocità di trasmissione nelle zanzare 18 .
Qui abbiamo un protocollo che descrive come coltivare i plasmidi infetti del clone, generare in vitro l' RNA virale a piena lunghezza (il genoma virale) e recuperare il virus infettivo nella coltura cellulare. In primo luogo, descriviamo la propagazione di plasmidi in batteri o amplificazione senza batteri usando l'amplificazione del cerchio di rotolamento (RCA). Successivamente, mostriamo come i due plasmidi vengono digeriti e successivamente legati insieme per generare virus a piena lunghezza. Infine, descriviamo la produzione di RNA trascritto e la sua successiva elettroporazione in cellule Vero, seguita da una titolazione del virus recuperato ( Figura 1 ). L'approccio descritto è rapido, permettendo perR recupero di scorte di virus infettive in 1-2 settimane.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero ringraziare Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic e Claudia Rückert per la loro assistenza nella caratterizzazione del virus derivato dal clone. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dell'Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive, NIH con sovvenzioni AI114675 (BJG) e AI067380 (GDE).
Materials
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
References
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