Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika
Summary
Este protocolo descreve a recuperação do vírus Zika infeccioso a partir de um clone de cDNA infeccioso com dois plasmídeos.
Abstract
Os clones de cDNA infecciosos permitem a manipulação genética de um vírus, facilitando assim o trabalho em vacinas, patogênese, replicação, transmissão e evolução viral. Aqui descrevemos a construção de um clone infeccioso para o vírus Zika (ZIKV), que atualmente está causando um surto explosivo nas Américas. Para evitar a toxicidade para bactérias comumente observadas com plasmídeos derivados de flavivírus, geramos um sistema de dois plasmídeos que separa o genoma no gene NS1 e é mais estável que as construções de comprimento total que não puderam ser recuperadas com sucesso sem mutações. Após a digestão e a ligação para unir os dois fragmentos, o ARN viral completo pode ser gerado por transcrição in vitro com polimerase de ARN T7. Após a eletroporação do ARN transcrito nas células, recuperou-se o vírus que apresentava cinética de crescimento in vitro semelhante e fenótipos de virulência e infecção in vivo em camundongos e mosquitos, respectivamente.
Introduction
O vírus Zika (ZIKV; Família Flaviviridae : Gênero Flavivírus ) é um flavivírus transmitido por mosquito que chegou ao Brasil em 2013-14 e posteriormente foi associado a um surto maciço de doença febril que se espalhou pelas Américas 1 . Além disso, o ZIKV tem sido associado a desfechos graves da doença, como a síndrome de Guillain-Barré em adultos e microcefalia em fetos e neonatos 2 . Pouco se sabia sobre ZIKV antes da sua rápida propagação no hemisfério ocidental. Isso incluiu a falta de ferramentas moleculares, dificultando assim a pesquisa mecanicista. Ferramentas moleculares para vírus, tais como clones de cDNA infecciosos, facilitam a vacina e o desenvolvimento terapêutico antiviral e permitem a avaliação de fatores genéticos virais relacionados à patogênese viral diferencial, resposta imune e evolução viral.
Os clones infecciosos de Flavivirus são conhecidos por serem altamente instáveis em bactérias devido a crPromotores procarióticos ypticos presentes em seus genomas 3 . Várias abordagens têm sido usadas para melhorar esse problema; Incluindo a inserção de repetições em tandem a montante das sequências virais 4 , mutação das seqüências promotoras procarióticas putativas 5 , dividindo o genoma em múltiplos plasmídeos 6 , vetores numéricos de baixa cópia (incluindo cromossomos artificiais bacterianos) 7 , 8 e inserção de intrões no genoma viral 9 . Um sistema completo sem modificações foi descrito para ZIKV; No entanto, este clone pareceu ser atenuado na cultura celular e em camundongos 10 . Outros grupos criaram intrões no genoma de ZIKV, permitindo a interrupção de seqüências instáveis em bactérias que podem ser empalmadas em células de mamíferos in vitro para a produção de vírus infecciosos 11, 12 . Além disso, um sistema baseado em PCR, intitulado Infectious-Subgenomic-Amplicons, foi utilizado com sucesso para resgatar o protótipo MR766 de ZIKV 13 . A abordagem descrita aqui não requer seqüências estranhas, mas sim interrompe o genoma na região de alta instabilidade usando múltiplos plasmídeos, que já foram utilizados com sucesso com vírus da febre amarela 6 , dengue 14 , 15 e do Nilo Ocidental 16 . Além disso, a adição da sequência de ribozima da hepatite D no terminal genômico viral facilita a criação de um autêntico final 3 'sem a necessidade de adicionar um site de linearização. Além disso, ambos os plasmídeos são construídos em um vetor de números de baixa cópia (pACYC177, ~ 15 cópias por célula) para mitigar qualquer toxicidade residual 17 . O vírus recuperado exibe um perfil de crescimento comparável aoVírus parental em curvas de crescimento in vitro em 8 linhas celulares compreendendo uma variedade de tipos de células derivadas de mamíferos e insetos e exibiu perfis patogênicos idênticos em camundongos e taxas de infecção, disseminação e transmissão em mosquitos 18 .
Aqui, detalhamos um protocolo descrevendo como cultivar os plasmídeos de clones infecciosos, gerar RNA viral completo (o genoma viral) in vitro e recuperar vírus infecciosos em cultura celular. Primeiro, descrevemos a propagação de plasmídeos em bactérias ou amplificação sem bactérias usando amplificação do círculo circulante (RCA). Em seguida, mostramos como os dois plasmídeos são digeridos e subsequentemente ligados em conjunto para gerar vírus de comprimento total. Finalmente, descrevemos a produção de ARN transcrito e sua subsequente eletroporação em células Vero, seguidas de titulação de vírus recuperado ( Figura 1 ). A abordagem descrita é rápida, permitindo queR recuperação de stocks de vírus infecciosos em 1-2 semanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic e Claudia Rückert por sua assistência na caracterização do vírus derivado de clones. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, NIH sob subsídios AI114675 (BJG) e AI067380 (GDE).
Materials
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
References
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