Analyse du Gap Junction-dependent Transfert de miARN avec microscopie 3D-FRAP
Summary
Ici, nous décrivons l'application de la récupération de fluorescence tridimensionnelle après photoblanchage (3D-FRAP) pour l'analyse de la permutation dépendant de la jonction de miRNA. Contrairement aux méthodes couramment appliquées, 3D-FRAP permet de quantifier le transfert intercellulaire de petits ARN en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle élevée.
Abstract
Les petits ARN antisens, comme le miARN et l'ARNi, jouent un rôle important dans la physiologie et la pathologie cellulaires et, en outre, peuvent être utilisés comme agents thérapeutiques dans le traitement de plusieurs maladies. Le développement de nouvelles stratégies novatrices pour la thérapie miRNA / siRNA repose sur une connaissance approfondie des mécanismes sous-jacents. Les données récentes suggèrent que les petits ARN sont échangés entre les cellules d'une manière dépendant de la jonction, ce qui induit des effets de régulation des gènes dans la cellule destinataire. Les techniques biologiques moléculaires et l'analyse cytométrique en flux sont couramment utilisées pour étudier l'échange intercellulaire du miARN. Cependant, ces méthodes ne fournissent pas une résolution temporelle élevée, ce qui est nécessaire lors de l'étude du flux de jonction entre les molécules. Par conséquent, pour étudier l'impact du miRNA / siRNA en tant que molécules de signalisation intercellulaire, de nouveaux outils sont nécessaires pour permettre l'analyse de ces petits ARN au niveau cellulaire. Le présent protocole décrit l'apPlication de la récupération de fluorescence tridimensionnelle après microscopie de photoblanchissement (3D-FRAP) pour élucider l'échange de molécules d'ARNm entre les cellules cardiaques. Il est important de noter que cette approche directe et non invasive d'imagerie en cellule vive permet de visualiser et de quantifier le passage à genoux jumelé de petits ARN marqués par fluorescence en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle élevée. Les données obtenues par 3D-FRAP confirment une nouvelle voie de régulation des gènes intercellulaires, où les petits ARN agissent comme des molécules de signalisation dans le réseau intercellulaire.
Introduction
Les petits ARN non codants sont des acteurs importants de la régulation des gènes cellulaires. Ces molécules sont composées de 20 à 25 nucleotides qui se lient à un ARNm cible spécifique, conduisant au blocage de la traduction ou à la dégradation 1 de l'ARNm. Le processus de réglementation des gènes entrepris par les petits ARN, tels que le miARN et l'ARNi, est un mécanisme hautement conservé qui a été trouvé dans de nombreuses espèces différentes 3 . En particulier, les molécules d'ARNm sont d'une importance cruciale pour une variété de processus physiologiques, y compris la prolifération, la différenciation et la régénération 4 , 5 . En outre, la dérégulation de l'expression de l'ARNm est attribuée à de nombreux troubles pathologiques. De manière correspondante, les ARNm ont été démontrés comme appropriés comme biomarqueurs pour le diagnostic et comme agents thérapeutiques pour la thérapie génique 6 , 7 </suP>.
Les jonctions d'écart (GJ) sont des structures de protéines spécialisées dans la membrane plasmique de deux cellules adjacentes qui permettent l'échange diffusaire de molécules avec un poids moléculaire allant jusqu'à 1 kD. Ils ont montré qu'ils étaient importants pour le développement tissulaire, la différenciation, la mort cellulaire et les troubles pathologiques tels que le cancer ou les maladies cardiovasculaires 8 , 9 , 10 . Plusieurs molécules ont été décrites comme étant capables de traverser les canaux GJ, y compris les ions, les métabolites et les nucléotides. Fait intéressant, les GJ ont également été trouvés pour fournir une voie pour le mouvement intercellulaire des petits ARN 11 , 12 . Ainsi, les miARN peuvent agir non seulement dans la cellule dans laquelle ils sont produits, mais aussi dans les cellules destinataires. Cela met en évidence le rôle des miARN dans le système de transduction du signal intercellulaire. Dans le même temps, les données démontrentCette communication intercellulaire de jonction gap est étroitement liée à la fonction miARN. En raison de l'impact significatif du miRNA et des GJ sur l'homéostasie des tissus, la pathologie et le diagnostic, une compréhension globale de la fonction des GJ et de la dynamique interellulaire associée au miARN aidera à clarifier les mécanismes des maladies à base de miARN et à développer de nouvelles stratégies pour Thérapies de l'ARNm.
Selon l'étendue du couplage jonctionnaire, le transfert de molécules d'ARNm entre les cellules peut être un processus très rapide. Par conséquent, une méthodologie permettant la visualisation et la quantification du mouvement intercelulaire rapide de ces molécules de signalisation réglementaire est nécessaire. Généralement, la cytométrie de flux et les techniques de biologie moléculaire ont été appliquées pour démontrer le déplacement des petits ARN 11 , 12 , 13 , 14 . Cependant, par opposition aux micros FRAPCopie, ces approches manquent d'une résolution temporelle élevée, ce qui est obligatoire lors de l'analyse de l'échange de miRNA via GJs. En outre, la microscopie FRAP est moins invasive et représente donc une puissante et nouvelle technique d'imagerie des cellules vivantes pour évaluer l'échange de molécules dépendantes de GJ dans plusieurs types de cellules 15 , 16 , 17 .
Ici, nous présentons un protocole détaillé décrivant l'application de 3D-FRAP pour évaluer le transfert de miARN entre les cardiomyocytes. À cette fin, les cardiomyocytes ont été transfectés avec un miARN marqué par fluorescence. Une cellule marquée par ce miARN a été photoblanchée, et le réintroduction de miARN par jonction entre les cellules adjacentes a été enregistrée de manière dépendant du temps. La résolution temporelle élevée des expériences FRAP offre la possibilité d'effectuer des études cinétiques pour l'évaluation précise du transfert intercellulaire de miARN et d'ARNi entre les cellules vivantes. MoreoEn effet, comme les petits ARN peuvent être échangés via différents mécanismes avec une cinétique très différente, la microscopie FRAP peut aider à préciser dans quelle mesure les GJ sont impliqués dans les processus respectifs de navette 18 . En outre, 3D-FRAP peut être utilisé pour étudier les altérations physiologiques et pathologiques de la perméabilité GJ et son impact sur le transfert d'un petit ARN 15 , 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Les miARN sont des acteurs clés de la physiologie cellulaire et ont été considérés comme des molécules de signalisation en utilisant entre autres les GJ comme voie d'échange intercellulaire 11 , 12 , 22 . Le protocole actuel présente une technique in vitro d'imagerie par cellule vivante pour caractériser ce transfert GJ-dependant en utilisant des ARNm fluorescents dans des grappes de cellules. </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Ministère fédéral de l'Education et de la Recherche Allemagne (FKZ 0312138A et FKZ 316159), l'État Mecklembourg-Poméranie occidentale avec les Fonds structurels de l'UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 et ESF / IVBM-B35-0010 / 12), le DFG (DA1296-1) et la Fondation allemande des cœurs (F / 01/12). En outre, RD est soutenu par le programme FORUN du Centre Médical de l'Université Rostock (889001), la Fondation DAMP et le BMBF (VIP + 00240).
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
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