3D-FRAP顕微鏡によるmiRNAのギャップジャンクション依存的転写の解析
Summary
ここでは、miRNAのギャップジャンクション依存シャトルを解析するために、光漂白（3D-FRAP）後の3次元蛍光回復の適用について説明します。一般的に適用される方法とは対照的に、3D-FRAPはリアルタイムで高空間/時間分解能で小RNAの細胞間移動の定量化を可能にする。
Abstract
miRNAおよびsiRNAのような小さなアンチセンスRNAは、細胞生理学および病理学において重要な役割を果たし、さらにいくつかの疾患の治療において治療薬として使用することができる。 miRNA / siRNA治療のための新しく革新的な戦略の開発は、根底にあるメカニズムの広範な知識に基づいています。最近のデータは、小さなRNAがギャップ結合依存的な様式で細胞間で交換され、それによってレシピエント細胞における遺伝子調節効果を誘導することを示唆している。分子生物学的技術およびフローサイトメトリー分析は、miRNAの細胞間交換を研究するために一般的に用いられる。しかしながら、これらの方法は、ギャップジャンクションの分子束を研究する際に必要とされる、高い時間分解能を提供しない。したがって、細胞内シグナル伝達分子としてのmiRNA / siRNAの影響を調べるためには、細胞レベルでのこれらの小さなRNAの分析を可能にする新規ツールが必要である。現在のプロトコルは、心臓細胞間のmiRNA分子のギャップジャンクション依存的交換を解明するために、光退色（3D-FRAP）顕微鏡法後の三次元蛍光回復の襞付け。重要なことに、この直接的で非侵襲的な生細胞イメージング手法により、蛍光標識された小さなRNAのギャップジャンクショナルシャトルを、時空間分解能の高いリアルタイムで視覚化および定量化することができます。 3D-FRAPによって得られたデータは、細胞間ネットワーク内のシグナリング分子として小さなRNAが作用する、細胞間遺伝子調節の新規な経路を確認する。
Introduction
小さな非コードRNAは、細胞遺伝子調節において重要な役割を担っている。これらの分子は、特定の標的mRNAに結合する20〜25個のヌクレオチドから構成され、翻訳の妨害またはmRNA分解に導く1,2 。 miRNAやsiRNAなどの小規模RNAが担う遺伝子調節プロセスは、多くの異なる種に見られる高度に保存されたメカニズムです3 。特に、miRNA分子は、増殖、分化および再生を含む様々な生理学的過程に極めて重要である4,5。さらに、miRNA発現の調節不全は、多くの病理学的障害に起因する。相応して、miRNAは、診断のためのバイオマーカーとして、および遺伝子治療のための治療剤として適切であることが実証されている6,7。 </sup>。
ギャップジャンクション（GJ）は分子量が最大1kDの分子の拡散交換を可能にする2つの隣接する細胞の原形質膜における特殊なタンパク質構造である。それらは、組織発生、分化、細胞死、および癌または心臓血管疾患などの病理学的障害にとって重要であることが示されている8,9,10。いくつかの分子は、イオン、代謝産物、およびヌクレオチドを含むGJチャネルを横切ることができると記載されている。興味深いことに、GJはまた、小RNA 11,12の細胞間移動のための経路を提供することが見出された。したがって、miRNAは、それらが産生される細胞内だけでなく、レシピエント細胞内でも作用することができる。これは、細胞間シグナル伝達系におけるmiRNAの役割を強調している。同時に、このデータは、ギャップジャンクショナル細胞間連絡はmiRNA機能と密接に関連している。組織恒常性、病理学および診断にmiRNAおよびGJが顕著に及ぼす影響のため、GJの機能およびmiRNAの関連する細胞間動態の包括的な理解は、miRNAに基づく疾患のメカニズムを明らかにし、 miRNA療法。
ギャップ接合カップリングの程度に依存して、細胞間のmiRNA分子の移動は非常に迅速なプロセスであり得る。したがって、これらの調節シグナル伝達分子の迅速な細胞間移動の視覚化および定量化を可能にする方法論が必要である。一般的に、フローサイトメトリーおよび分子生物学的技術が、小RNA 11,12,13,14のシャトルを実証するために適用されている。しかし、FRAPマイクロとは対照的にこれらの手法は、高い時間分解能を欠いており、これはGJを介したmiRNAの交換を分析する際に必須である。さらに、FRAP顕微鏡法は侵襲性が低く、したがって、いくつかの細胞タイプ15,16,17における分子のGJ依存性交換を評価するための強力で新規な生細胞撮像技術を代表する。
ここでは、心筋細胞間のmiRNAシャトルを評価するための3D-FRAPの応用を記述する詳細なプロトコルを提示する。この目的のために、心筋細胞を蛍光標識されたmiRNAでトランスフェクトした。このmiRNAでマークされた細胞を光退色させ、隣接する細胞からのギャップ接合型miRNA再流入を時間依存的に記録した。 FRAP実験の高い時間分解能は、生存細胞間のmiRNAおよびsiRNAの細胞間移動の正確な評価のための動態学的研究を行う可能性を提供する。モレエFRAP顕微鏡法は、GJがそれぞれのシャトルプロセスにどの程度関わっているかを明らかにするのに役立ちます18 。さらに、3D-FRAPは、GJ透過性における生理学的および病理学的変化および小RNA伝達に対するその影響を調べるために使用することができる15,19。
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAは、細胞生理学における重要な役割を果たしており、とりわけGJを細胞間の経路11,12,22の経路として使用することで、シグナル伝達分子として働くことが示されています。現在のプロトコールは、細胞クラスター内の蛍光miRNAを用いてこのGJ依存シャトルを特徴付けるインビトロ生細胞撮像技術を提示している。
プロトコールは、細胞モデル系として心筋細…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、ドイツ連邦教育研究省（FKZ 0312138AおよびFKZ 316159）、EU構造基金（ESF / IVWM-B34-0030 / 10およびESF / IVBM-B35-0010 / 12）、DFG（DA1296-1）、およびドイツ心臓財団（F / 01/12）が含まれる。さらに、RDは、ロストック大学医療センター（889001）のFORUNプログラム、DAMP財団、およびBMBF（VIP + 00240）によってサポートされています。
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
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