Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse
Summary
Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.
Abstract
I neuroni cerebellari del granello (CGNs) sono un modello comunemente usato neuronale, formando una popolazione omogenea abbondante nel cervelletto. Alla luce del loro sviluppo post-natale, abbondanza e accessibilità, CGNs sono un modello ideale per studiare processi neuronali, compreso lo sviluppo neuronale, migrazione neuronale e stimolazione di attività neuronale fisiologica. Inoltre, culture CGN forniscono un eccellente modello per studiare le diverse modalità di morte cellulare tra cui excitotoxicity e apoptosi. All’interno di una settimana nella cultura, CGNs esprimere recettori N-metil-D-aspartato (NMDA), un recettore di glutammato di specifici recettori ionotropici con molte funzioni critiche in un neurone salute e nella malattia. L’aggiunta di basse concentrazioni di NMDA in combinazione con la depolarizzazione della membrana di roditore colture primarie di CGN è stato utilizzato per modellare la stimolazione fisiologica attività neuronale, mentre l’aggiunta di alte concentrazioni di NMDA può essere impiegato per modellare lesione di un neurone excitotoxic. Qui, un metodo di isolamento e coltura di CGNs da cuccioli 6 giorno precedente così come la manipolazione genetica di CGNs da adenovirus e lentivirus sono descritti. Siamo anche presenti protocolli ottimizzati su come stimolare eccitotossicità indotta da NMDA, apoptosi indotta da basso-potassio, stress ossidativo e danno al DNA dopo la trasduzione di questi neuroni.
Introduction
I neuroni cerebellari del granello (CGNs) sono ben caratterizzati in cultura e hanno servito come un modello efficace per studiare la morte neuronale e sviluppo 1,2,3,4,5, 6. l’espressione precoce dei recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) CGN culture in vitro di li rende un modello interessante per studiare NMDA-indotta di segnalazione. L’attivazione di questi recettori con NMDA in combinazione con la depolarizzazione della membrana viene utilizzata per modellare la stimolazione fisiologica attività neuronale e ha permesso per la ricerca dei meccanismi di plasticità sinaptica 7,8. Al contrario, eccesso di stimolazione di questi recettori da ligando NMDA può essere utilizzato per modellare excitotoxicity, un meccanismo importante di perdita neuronale in malattie di neurodegenerative e danno cerebrale acuta 9. Un meccanismo per l’induzione di excitotoxicity è attraverso inedia ATP con ossigeno ridotto, come si è visto con la ferita di un neurone acuta. In questo modo la depolarizzazione della membrana e rilasciano di livelli elevati di glutammato in sinapsi. La sovrastimolazione successiva del recettore NMDA da elevati del glutammato provoca eccessiva Ca2 + afflusso attraverso questi recettori, che a sua volta attiva diverse vie tra cui Ca2 +-attivati proteasi, fosfolipasi, e endonucleasi, conseguente la degradazione incontrollata dei critici componenti cellulari e morte cellulare. Inoltre, alta intracellulare Ca2 + porta alla generazione di radicali liberi dell’ossigeno e danno mitocondriale 10,11.
Mentre la maggior parte della perdita di un neurone seguendo eccitotossicità neuronale indotta da NMDA è dovuto afflusso del calcio ed è indipendente di Bax e Bak, altri meccanismi di morte cellulare non possono essere escluso da questo modello. L’aspetto di entrambi necrotico e apoptotici come la morte delle cellule dovuto excitotoxicity è parzialmente dovuto alla generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e danni al DNA causati daalta intracellulare Ca 2 + livelli 12. Danno del DNA risultati nella morte neuronale attraverso meccanismi apoptotici, essendo correlati con tratti distintivi della morte apoptotica delle cellule, come la comparsa di masse di cromatina e corpi apoptotici. Induzione di apoptosi è mediata attraverso il rilascio di citocromo c dai mitocondri e ha dimostrato di essere dipendente da Bax/Bak oligomerizzazione 13. Oligomerizzazione di Bax/Bak promuove la formazione di pori nella membrana mitocondriale esterna, con conseguente rilascio del citocromo c e l’attivazione dei regolatori pro-apoptotiche come si è visto con una lieve lesione ischemica 14.
Generazione di ROS è un problema significativo nel cervello dovuto i bassi livelli endogeni di antiossidanti, accoppiati con il fabbisogno di ossigeno grande per funzionamento neuronale 15. Quando esposti ad un evento ischemico, ossido nitrico sintasi è aumentata, produzione di ossido nitrico e l’aumento di specie reattive dell’ossigeno 14. L’aumento della concentrazione dei radicali dell’ossigeno può provocare danni al DNA e causare indirettamente la fame di energia. Alti livelli di rotture del doppio filamento del DNA sono sanati mediante l’attivazione di poli ADP-ribosio polimerasi-1 (PARP-1), un’eucariota cromatina-proteina responsabile di che catalizza il trasferimento di unità di ADP-ribosio dal NAD+, un parte integrante del processo 16di riparazione del DNA. Tuttavia, con danni eccessivi a causa dello stress ossidativo, attivazione di PARP-1 può causare fame di energia dovuto lo scarico aumentato il NAD+, un substrato necessario per la produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. In definitiva, lo sforzo ossidativo si innescherà apoptosi in un modo dipendente di Bax/Bak che conduce al rilascio mitocondriale del citocromo c ed è stato indicato per indurre il rimodellamento mitocondriale in CGNs 17.
Infine, cambiamenti nella concentrazione di cloruro di potassio (KCl) in colture CGN possono essere utilizzati per modellare basso potassio/depolarizzazione mediata apoptosi 18,19,20. Quando esposti a bassi livelli di K+, CGNs subiscono cambiamenti fisiologici distinti, con conseguente riduzioni di respirazione mitocondriale e di glicolisi, attribuito alla diminuzione della domanda cellulare 21, così come la riduzione dei livelli di Nuclear factor-f-κB (NFκB) che regola le attività tra cui l’infiammazione e la trasmissione sinaptica 22. Questo modello è di particolare interesse per lo studio della morte delle cellule durante lo sviluppo neuronale. L’ambiente di K+ basso più strettamente assomiglia a condizioni fisiologiche e provoca i tratti distintivi della morte delle cellule durante lo sviluppo neuronale 23.
In sintesi, CGNs forniscono un modello di vecchia data per studiare i meccanismi molecolari sottostanti di degenerazione e morte neuronale. Il seguente protocollo permetterà di isolamento e coltura di CGNs, espressione o repressione di una particolare via genetica utilizzando virus e l’induzione della morte neuronale attraverso diversi meccanismi che rappresenta la degenerazione e la lesione di un neurone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui forniamo un metodo semplice per la coltura di neuroni cerebellari del granello di mouse primario (CGNs), perdita e guadagno di funzione studia e modellazione di diversi meccanismi di morte cellulare. Diversi fattori influenzano la riproducibilità dei risultati utilizzando questa procedura che richiedono un attento monitoraggio. Questi includono la purezza della cultura tra cui l’eliminazione delle cellule gliali nella cultura, alla confluenza della cultura e mantenere le cellule sane. L’introduzione di variabilità …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada e la canadese istituti di ricerca sanitaria concede a A.J.-A.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
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