神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング
Summary
このプロトコルを記述する簡易分離し培養 6 7 日古い子犬、CGNs の損失のための効率的な伝達と機能の研究、益からプライマリ マウス脳顆粒ニューロン (CGNs) と nmda 刺激による神経毒性、モデリング法低カリウムによって誘導される細胞死、DNA 損傷と同じ文化モデルを用いた酸化ストレス。
Abstract
小脳顆粒ニューロン (CGNs) が一般的に使用される神経のモデルは、小脳の豊富な同質な人口を形成です。自分の出生後の開発、豊富とアクセシビリティの観点から CGNs が神経突起は、神経発生、神経移行、生理学的神経刺激などの研究に理想的なモデルです。加えて、CGN 文化は応需型やアポトーシスなどの細胞死の別のモードを研究するためのエクセレント モデルを提供します。文化週間以内は、CGNs は、N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体、神経の健康および病気の多くの重要な機能を備えた特定イオン型グルタミン酸受容体を表現します。齧歯動物の初代 CGN 培養膜脱分極電位と組み合わせて NMDA の低濃度添加は NMDA の高濃度添加をモデルに用いることができる生理学的神経刺激モデルに使用されています顎神経細胞傷害。ここでは、分離法、アデノ ウイルス、レンチで CGNs の遺伝子操作と同様に、6 日間の古い子犬から CGNs の培養を説明します。我々 は NMDA 誘発毒性、低カリウムによるアポトーシスの誘導、酸化ストレス、これらのニューロンの情報伝達に続く DNA 損傷を刺激する方法も現在の最適化されたプロトコル。
Introduction
小脳顆粒ニューロン (CGNs) 文化によく特徴があり、神経細胞死および開発1,2,3,4,5,を勉強する効果的なモデルを務めています。6。 CGN 文化の in vitro N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体の早期発現が nmda シグナル伝達研究に魅力的なモデルをさせます。膜脱分極と組み合わせて NMDA とこれらの受容体の活性化は生理学的神経刺激をモデル化する使用され、シナプス可塑性7,8のメカニズムに研究の許可されています。それどころか、応需型、急性脳損傷や神経変性疾患9で神経細胞の損失の主要なメカニズムをモデル化する NMDA リガンドによるこれらの受容体の過剰刺激を使用できます。応需型の誘導のメカニズムの 1 つは、急性神経障害と見られる減らされた酸素は、ATP 飢えです。これは、結果、膜の脱分極でグルタミン酸のレベルが上昇、および解放シナプス。過剰な Ca2 +流入これらの受容体を介した Ca2 +を含むいくつかの経路を順番にアクティブに昇格したグルタミン酸により NMDA 受容体の後続の overstimulation-活性化プロテアーゼ、ホスホリパーゼと酵素、重要な細胞内成分および細胞死の制御不能な劣化の結果します。さらに、高い細胞内 Ca2 +酸素フリーラジカルとミトコンドリア損傷10,11の発生につながります。
一方 nmda 刺激による神経毒性に伴う神経の損失の大半はカルシウム流入によるもので、バックス/博独立、細胞死の他のメカニズムは、このモデルから除外できません。壊死の両方の外観とアポトーシス毒性による細胞死は部分的に高い細胞内 Ca 2 +レベル12によって引き起こされる DNA 損傷反応酸素種 (ROS) の生成のためのような。DNA 損傷はアポトーシス細胞死は、クロマチンの固まりおよびアポトーシス小体の外観などの特徴と関連づけられている、アポトーシスのメカニズムによって神経細胞死の結果します。アポトーシスの誘導、ミトコンドリアからシトクロム c の放出を介したし、バックス/Bak 重合13に依存するが示されています。バックス/Bak 重合は、シトクロム c の放出およびプロアポトーシス レギュレータ、軽度の虚血性損傷14で見るの活性化の結果、外ミトコンドリア膜の細孔形成を推進しています。
ROS の生成は、酸化防止剤、神経機能15の大きな酸素要求と相まって低内因性レベルのため脳に重要な問題です。虚血性イベントにさらされる, 一酸化窒素合成酵素は誘導、一酸化窒素の生産および活性酸素種14の増加です。酸素ラジカルの濃度の増加は DNA 損傷が発生し、エネルギー飢餓を間接的に引き起こす可能性ができます。ポリ ADP リボース ポリメラーゼ 1 (PARP 1)、真核生物のクロマチン結合タンパク質触媒 NAD+に不可欠なプロセスから ADP リボース単位の転送を担当の活性化で改善する DNA 二本鎖切断の高レベルDNA 修復の16。しかし、酸化ストレスによる過度の損傷、PARP 1 活性化を引き起こす可能性が増加ドレインによるエネルギー飢餓 NAD+、酸化的リン酸化による ATP の生産に必要な基板上。最終的には、酸化ストレスがミトコンドリアのチトクローム c の放出につながるバックス/Bak 依存的にアポトーシスを引き起こすし、CGNs 17ミトコンドリア リモデリング誘導するために示されています。
最後に、塩化カリウム (KCl) CGN の文化での濃度の変化は、低カリウム/脱分極を介したアポトーシス18,19,20をモデルに使用できます。K+の低レベルにさらされる, CGNs ではミトコンドリアの呼吸と解糖系、携帯電話需要の減少21に帰因する両方の削減としてのレベルの減少の結果異なる生理学的変化を受ける核因子 κ b (nf κ B) 炎症とシナプス伝達22を含む活動を調整します。このモデルは、神経細胞の開発の間に細胞死の研究の特定の興味のです。低 K+環境はより密接に生理学的な条件のようなし、により、神経発生23中に見られる細胞死の特徴。
要約すると、CGNs は神経細胞死と変性の分子メカニズムを調査するため長年モデルを提供します。次のプロトコルの分離、CGNs、式またはウイルスと神経細胞傷害と変性を表す異なるメカニズムを介して神経細胞死の誘導を使用して特定の遺伝経路の抑制培養できるようになります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここのプライマリ マウス小脳顆粒ニューロン (CGNs)、損失と利得の機能の研究、培養と細胞死のメカニズムのモデル化の簡単な方法を提供します。綿密なモニタリングを必要とするこの手順を使用して結果の再現性に影響を与えるいくつかの要因。文化、文化の合流点にグリア細胞の除去などを含むと健康な細胞を維持する文化の純度が含まれます。これらの要因の変動を導入することで、?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は自然な科学および工学研究評議会カナダのによってサポートされ A.J. a 健康の研究のカナダの協会が助成金
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
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