Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen
Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om te isoleren en primaire muisknop cerebrale submodule neuronen (CGNs) van 6-7 dag oud pups, efficiënte transductie van CGNs voor verlies en winst van functie studies, kweken en modellering NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity, lage-kalium-veroorzaakte celdood, DNA-schade en oxidatieve stress met behulp van de zelfde cultuur-model.
Abstract
Cerebellaire submodule neuronen (CGNs) zijn een veelgebruikte neuronale model, vormen een overvloedige homogene bevolking in het cerebellum. In het licht van hun postnatale ontwikkeling, overvloed en toegankelijkheid zijn CGNs een ideaal model om neuronale processen, met inbegrip van neuronale ontwikkeling, neuronale migratie en fysiologische Neuronale activiteit stimulatie te bestuderen. Daarnaast bieden de CGN culturen een uitstekend model voor het bestuderen van de verschillende vervoerswijzen met inbegrip van excitotoxicity en apoptosis van de dood van de cel. Binnen een week in cultuur express CGNs N-methyl-D-aspartaat (NMDA)-receptoren, een specifieke ionotropic glutamaat-receptor met vele kritische functies in neuronale gezondheid en ziekte. De toevoeging van lage concentraties van NMDA in combinatie met membraan depolarisatie knaagdier primaire CGN culturen is gebruikt voor het modelleren van fysiologische Neuronale activiteit stimulatie, terwijl de toevoeging van hoge concentraties van NMDA kan worden gebruikt om het model excitotoxic neuronale schade. Hier, worden een methode van isolement en kweken van CGNs van 6 dag oud pups, alsmede de genetische manipulatie van CGNs door adenovirussen en lentivirussen beschreven. Wij ook aanwezig geoptimaliseerde protocollen over hoe NMDA-geïnduceerde excitotoxicity, laag-kalium-veroorzaakte apoptosis, oxidatieve stress en DNA-schade na transductie van deze neuronen te stimuleren.
Introduction
Cerebellaire submodule neuronen (CGNs) worden ook gekenmerkt in cultuur en hebben gediend als een effectieve model om te studeren neuronale dood en ontwikkeling 1,2,3,4,5, 6. de vroege expressie van N-methyl-D-aspartaat (NMDA)-receptoren in de CGN culturen in vitro maakt hen een aantrekkelijk model te bestuderen NMDA-geïnduceerde signalering. Activering van deze receptoren met NMDA in combinatie met membraan depolarisatie wordt gebruikt voor het modelleren van fysiologische Neuronale activiteit stimulatie, en heeft toegestaan voor onderzoek naar de mechanismen van synaptische plasticiteit 7,8. Integendeel, kan overmatige stimulatie van deze receptoren door NMDA ligand worden gebruikt voor het model van excitotoxicity, een grote mechanisme van neuronale schade in acute schade aan de hersenen en neurodegeneratieve ziekten 9. Een mechanisme voor de inductie van excitotoxicity is door middel van ATP honger met verminderde zuurstof, zoals gezien bij acute neuronale schade. Dit leidt tot membraan depolarisatie en verhoogde niveaus van glutamaat vrij in de synaps. De daaropvolgende overstimulatie van de NMDA-receptor door verhoogde glutamaat resulteert in buitensporige Ca2 + toestroom via deze receptoren, die op zijn beurt activeert verschillende trajecten met inbegrip van Ca2 +-geactiveerd proteasen, phospholipases, en enzym, resulterend in de ongecontroleerde afbraak van kritische cellulaire componenten en celdood. Bovendien, leidt hoge intracellulaire Ca2 + tot de generatie van zuurstof vrije radicalen en mitochondriale schade 10,11.
Terwijl de meerderheid van de neuronale verlies na NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity te wijten aan de calcium toestroom is en Bax/Bak onafhankelijk is, kunnen niet andere mechanismen van celdood worden uitgesloten van dit model. Het uiterlijk van beide necrotische en apoptotic zoals celdood als gevolg van excitotoxicity gedeeltelijk te wijten aan de generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) en DNA-schade veroorzaakt doorhoge intracellulaire Ca 2 + niveaus 12 is. DNA-beschadiging resulteert in neuronale dood door middel van apoptotic mechanismen, worden gecorreleerd met kenmerken van apoptotic celdood, zoals het uiterlijk van de chromatine massa’s en de apoptotic organen. Inductie van apoptosis is bemiddeld door de vrijlating van cytochroom c uit de mitochondriën, en heeft aangetoond dat Bax/Bak oligomerisatie 13afhankelijk te zijn. Bax/Bak oligomerisatie bevordert porie vorming in de buitenste mitochondriale membraan, wat resulteert in cytochroom c release en de activering van de regelgevers van de pro-apoptotic zoals gezien met milde ischemische schade 14.
Generatie van ROS is een belangrijke kwestie in de hersenen als gevolg van de lage endogene niveaus van antioxidanten, gekoppeld aan de eis van de grote zuurstof voor neuronale functionerende 15. Wanneer blootgesteld aan een ischemische gebeurtenis, is stikstofoxide synthase upregulated, productie van stikstofmonoxide en het vergroten van reactieve zuurstof soorten 14. De verhoogde concentratie van zuurstof radicalen kan resulteren in DNA-beschadiging en niet indirect veroorzaken energie honger. Hoge niveaus van DNA double-stranded pauzes worden verholpen door de activering van poly ADP-ribose polymerase-1 (PARP-1), een eukaryote chromatine-gebonden eiwit dat verantwoordelijk is voor het katalyseren van de overdracht van ADP-ribose eenheden van NAD+, een proces dat integraal deel uitmaakt van 16van de reparatie van DNA. Met buitensporige schade als gevolg van oxidatieve stress, PARP-1 activering kan echter leiden tot energie honger als gevolg van de verhoogde afvoer op NAD+, een noodzakelijke substraat voor ATP productie door middel van oxidatieve fosforylering. Uiteindelijk, oxidatieve stress zal leiden tot apoptosis in een Bax/Bak afhankelijke wijze leidt tot mitochondriale cytochroom c release, en is gebleken voor het opwekken van mitochondriale reorganisatie in CGNs 17.
Ten slotte, veranderingen in de concentratie van kaliumchloride (KCl) in CGN culturen kunnen worden gebruikt om model te lage kalium/depolarisatie gemedieerde apoptosis 18,19,20. Wanneer blootgesteld aan lage niveaus van K+, ondergaan CGNs verschillende fysiologische veranderingen, wat resulteert in kortingen van mitochondriale ademhaling zowel glycolyse, toegeschreven aan verminderde cellulaire vraag 21, evenals vermindering van nucleaire factor-recombination (NFκB) die activiteiten, met inbegrip van ontsteking en synaptische transmissie 22regelt. Dit model is van bijzonder belang voor het bestuderen van celdood tijdens neuronale ontwikkeling. De lage K+ environment nauwer lijkt op fysiologische omstandigheden en kenmerken van celdood gezien tijdens neuronale ontwikkeling 23veroorzaakt.
Kortom bieden CGNs een langdurige model voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen van neuronale dood en degeneratie. Het volgende protocol kan isolatie en kweken van CGNs, expressie of onderdrukking van een bepaalde genetische traject met behulp van virussen en de inductie van neuronale dood via verschillende mechanismen die neuronale schade en degeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij bieden hier een eenvoudige methode voor het kweken van primaire muisknop cerebellaire submodule neuronen (CGNs), verlies en aanwinst van functie studies, en modelleren van verschillende vormen van dood van de cel. Verschillende factoren beïnvloeden de reproduceerbaarheid van de resultaten met behulp van deze procedure waarvoor nauwlettend te worden gevolgd. Het gaat hierbij om de zuiverheid van de cultuur, waaronder de verwijdering van gliale cellen in de cultuur, de samenvloeiing van de cultuur, en het behoud van g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek verleent aan A.J.-A.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
References
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
