תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים
Summary
בשיטה זו, אנו משתמשים photopolymerization, לחץ על כימיה טכניקות ליצירת דפוסים חלבון או פפטיד על פני השטח של hydrogels פוליאתילן גליקול (PEG), מתן מתאושש אותות ביו לצורך המחקר של תגובות הסלולר במבחנה .
Abstract
ישנם גירויים ביולוגיים רבים יכולים להשפיע על התנהגות תאית התמיינות תאי גזע. גישות התרבות התא הכללית להסתמך על גורמים מסיסים בתוך המדיום כדי לשלוט בהתנהגות התא. עם זאת, תוספות מסיסים לא יכולים לחקות מסוימים איתות מוטיבים, כגון גורמי גדילה מטריקס מכורך איתות התא-התא, רמזים הביוכימי המרחבי, אשר נפוץ השפעות על תאים. יתר על כן, מאפיינים ביופיזיקלי של המטריקס, כגון קשיחות המצע, לשחק תפקידים חשובים בגורל התא, אשר לא בקלות מטופל באמצעות תא קונבנציונאלי culturing פרקטיקות. בשיטה זו, אנו מתארים פרוטוקול ישיר לספק חלבונים ביו בדוגמת על hydrogels סינתטי פוליאתילן גליקול (PEG) באמצעות פוטוכימיה. פלטפורמה זו מאפשרת שליטה עצמאית של המצע נוקשות ועל סימנים ביוכימיים מרחבית. Hydrogels אלה ניתן להשיג מגוון רחב של ערכים נוקשות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, המשטחים של אלה hydrogels יכול להיות photopatterned עם פפטידים ביו או חלבונים באמצעות תיול-ene לחץ על תגובות כימיה. שיטות אלה מוטבו כדי לשמור על תפקוד החלבון לאחר הנייח משטח. זהו פרוטוקול צדדי ניתן להחיל על כל חלבון או פפטיד עניין כדי ליצור מגוון של תבניות. לבסוף, תאים נזרע על גבי המשטחים של אלה hydrogels ביואקטיביות ניתן לנטר לאורך זמן גם הם להגיב על אותות ספציפית במרחב.
Introduction
ישנם גירויים רבים המשפיעים בהתנהגות התא. באופן כללי, טכניקות culturing תא אופייני להסתמך על גורמים מסיסים להפיק תגובות הסלולר; עם זאת, קיימות מגבלות לגישה זו. שיטות אלה אינם מסוגלים להציג במדויק כל המוטיבים איתות מתמקמות ויוו. מנגנוני איתות כאלה כוללים גורמי גדילה מוחרמת, איתות התא-התא סימנים ביוכימיים ספציפיים במרחב. יתר על כן, קשיחות המצע יכול לשחק תפקיד חשוב התנהגות תאית התמיינות תאי גזע, לא בקלות מטופל באמצעות נפוצות תא culturing שיטות1,2. גישות biomaterial מציעים פלטפורמה חדשה להתחיל לחקור מנגנונים אלה איתות. בפרט, hydrogels הם מועמדים מצוינים עבור כוונון המצע נוקשות3,4, שיתק חלבונים ופפטידים5,6, ויצירת דפוסי במרחב מסוים7, 8.
Hydrogels משמשים בתור פיגומים בהנדסת רקמות עקב שלהם מכנה משותף biophysical וביוכימי עם מטריצה חוץ-תאית (ECM)9,10. פולימרים טבעיים הם אפשרויות נפוצות פיגומים, הם מסתיימים, נמצאים ברקמות רבות בגוף. המגבלה של שימוש פולימרים טבעיים בשם דיאלקטריים היא היעדר בקלות בעורמה moieties כימיים עבור bioconjugation. מצד שני, hydrogels סינתטי, וככזה כמו יתד, הם מצוינים פלטפורמות בדיקות, הביוכימיה יישוב11,12. בנוסף, פג hydrogels לא זכה לתגובה הסלולר, ולכן משמשים כמו עמוד השדרה אינרטי ליצירת ביו פיגומים.
כדי ליצור hydrogels ביו, הן photopolymerization והן תיול-ene לחץ על כימיה תגובות הם מועסקים. Photoreactions אלה דורשים photoinitiator של מקור אור UV. כאשר photoinitiators מוצגים בפני אור UV, חוב לבשר טופס רדיקלים. תזות רדיקלים הדרושים לאתחול התגובה אך יכול להשפיע לרעה על חלבון bioactivity12,13. לכן, זה הכרחי למטב את photoinitiator ושעות החשיפה UV כדי לשמור על חלבון bioactivity.
בשיטה זו, hydrogels הם מסונתז דרך אקרילט-אקרילט שרשרת צמיחה photopolymerization. מונומרים פג-diacrylate (PEGDA) מגיבים עם השני כדי ליצור רשתות פולימריות מסועף אחראי על המבנה של הידרוג. הריכוז של מונומרים PEGDA בתוך הפתרון קודמן ג’ל ישלוט הקשיחות המצע. עקב הקטן גודל של הידרוג הנקבוביות, ECM חלבונים כגון fibronectin ניתן לשלב בקלות בתוך הידרוג לצורך התא מצורף. לבסוף, hydrogels אלה יכול להיות בדוגמת השטח עם פפטידים ביו או חלבונים באמצעות תיול-ene לחץ על תגובות כימיה. כאן, unreacted acrylates חינם בתוך מערכת הידרוג יגיבו תיולים חינם ממוקמים חלבון או פפטיד בעת חשיפה לאור UV. לאחר חלבונים או פפטידים נמצאים ותשמרו על פני הידרוג, הידרוג ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות מבלי לאבד את bioactivity. זה מציע נוחות, תכנון ניסויי גמיש, ועל האפשרות לשיתוף פעולה בין מעבדות. בסך הכל, פלטפורמה זו מאפשרת biomechanical המרחבי הביוכימי ושליטה, תלויות זו בזו, על ההזדמנות להשפיע על התנהגות הסלולר.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת חלבון ביואקטיביות תבניות עבור יישומים ביולוגיים. ישנם מספר שינויים שניתן להתאים פרוטוקול זה לניסויים שונים. ראשית, דרישות מצורף התא ישתנו עבור סוגי תאים שונים. אם הקובץ המצורף תא המסכן ג’לים נצפית בתחילה, הגדלת ריכוז החלבון ECM בתוך הפתרון קודמן מומלץ. לחלבונים …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה בעיקר נתמך על ידי מענקים אמריקאי איגוד הלב המענק מדען פיתוח (12SDG12050083 לגלובל דיינמיקס), מכוני הבריאות הלאומיים (R21HL102773, R01HL118245 לגלובל דיינמיקס), הקרן הלאומית למדע (CBET-1263455, CBET-1350240 לגלובל דיינמיקס).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/…/MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017)
- Ellman’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017)
- Desalting Columns. GE Life Sciences Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017)
