Padronização bioativas proteínas ou peptídeos em hidrogel usando fotoquímica para aplicações biológicas
Summary
Neste método, utilizamos a fotopolimerização e técnicas de química clique para criar padrões de proteína ou peptídeo na superfície de hidrogel de polietileno glicol (PEG), fornecendo imobilizada sinais bioativos para o estudo da resposta celular em vitro .
Abstract
Existem muitos estímulos biológicos que podem influenciar a diferenciação celular de comportamento e células-tronco. Abordagens de cultura celular geral dependem de fatores solúveis dentro o meio para controlar o comportamento de célula. No entanto, adições solúveis não podem imitar determinados motivos, tais como fatores de crescimento ligados a matriz de sinalização, sinalização celular e espaciais pistas bioquímicas, que são influências comuns em células. Além disso, as propriedades biofísicas da matriz, tais como a rigidez do substrato, desempenham importantes funções no destino da célula, que não é facilmente manipulado usando celular convencional, as práticas de cultivo. Neste método, descrevemos um protocolo simples para fornecer proteínas bioativas estampadas em hidrogel sintético polietileno glicol (PEG) usando fotoquímica. Esta plataforma permite o controle independente de tacos de bioquímicos espaciais e rigidez do substrato. Estes hidrogel pode alcançar uma grande gama de valores de rigidez fisiologicamente relevantes. Além disso, as superfícies destes hidrogel podem ser photopatterned com peptídeos bioativos ou proteínas através do thiol-ene clique em reações de química. Esses métodos foram otimizados para manter a função da proteína após imobilização de superfície. Este é um protocolo versátil que pode ser aplicado a qualquer proteína ou peptídeo de interesse para criar uma variedade de padrões. Finalmente, células semeadas nas superfícies destes hidrogel bioativos podem ser monitoradas ao longo do tempo como eles respondem aos sinais espacialmente específicos.
Introduction
Existem muitos estímulos que influenciam o comportamento da célula. Geralmente, as técnicas de cultivo de célula típica dependem de fatores solúveis para eliciar respostas celulares; no entanto, existem limitações para esta abordagem. Esses métodos não são capazes de exibir com precisão todos os motivos de sinalização comumente encontrados in vivo. Tais mecanismos de sinalização incluem sequestrados e fatores de crescimento, sinalização celular, sinais bioquímicos espacialmente específicas. Além disso, a rigidez do substrato pode desempenhar um papel importante na diferenciação de comportamento e células-tronco de células e não é facilmente manipulado usando celular comum cultivo práticas1,2. Abordagens de biomaterial para oferecer uma nova plataforma para começar a explorar esses mecanismos de sinalização. Em particular, o hidrogel é excelentes candidatos para ajuste de substrato rigidez3,4, imobilização de proteínas e peptídeos5,6e criando padrões específicos espacialmente7, 8.
Hidrogel é comumente usados como andaimes em engenharia de tecidos devido a suas semelhanças bioquímicas e biofísicas com a matriz extracelular (ECM)9,10. Polímeros naturais são opções comuns para andaimes, que são biocompatíveis e são encontrados em muitos tecidos do corpo. A limitação do uso de polímeros naturais como substratos é que faltam partes químicos facilmente manipulados para bioconjugation. Por outro lado, o hidrogel sintético, como tal como PEG, é excelentes plataformas para químicos alvo11,12. Além disso, PEG hidrogel não eliciar uma resposta celular e, portanto, é usados como backbones de inertes para a criação de andaimes bioativos.
Para criar o hidrogel bioativos, tanto fotopolimerização e tiol-ene clique química reações são empregadas. Estes photoreactions requerem um fotoiniciador e uma fonte de luz UV. Quando Fotoiniciadores são introduzidas à luz UV, laços quebrar a radicais de formulário. Radicais de teses são necessários para iniciar a reação, mas podem afetar negativamente a proteína Bioatividade12,13. Portanto, é fundamental otimizar o fotoiniciador e tempos de exposição UV para manter a bioatividade de proteína.
Neste método, o hidrogel é sintetizados através de acrilato-acrilato fotopolimerização de crescimento de cadeia. Monômeros de PEG-diacrylate (PEGDA) reagem uns com os outros para formar redes de polímero ramificado responsável pela estrutura do hidrogel. A concentração de monómeros PEGDA dentro da solução de precursor de gel controlará a rigidez do substrato. Devido o pequeno pore tamanho do hidrogel, proteínas de ECM como fibronectina podem ser facilmente incorporadas dentro o hidrogel para efeitos de fixação da célula. Finalmente, estes hidrogel pode ser superfície-estampados com peptídeos bioativos ou proteínas através do thiol-ene clique em reações de química. Aqui, não tenha reagidos acrilatos livre dentro do sistema de hidrogel reagirá com tióis livre localizados na proteína ou peptídeo quando exposto à luz UV. Depois que as proteínas ou peptídeos são imobilizados na superfície de hidrogel, o hidrogel pode ser armazenado a 4 ° C durante várias semanas sem perder a bioatividade. Isto oferece conveniência, planejamento experimental flexíveis e a possibilidade de colaboração entre laboratórios. Em geral, esta plataforma permite biomecânica e espacial controle bioquímico, independente uns dos outros, pela oportunidade de influenciar o comportamento celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece um método para criar padrões de proteína bioativos para aplicações biológicas. Existem várias modificações que podem ser feitas para se adaptar a este protocolo para experiências diferentes. Primeiro, requisitos de ligação de celular pode variar para diferentes tipos de células. Se acessório celular pobre para os géis é observado inicialmente, aumentando a concentração da proteína dentro da solução de precursor do ECM é aconselhada. Outras proteínas de ECM podem ser usadas em…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado principalmente por concessões do coração americano Associação cientista desenvolvimento concessão (12SDG12050083 a G.D.), o National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 a G.D.) e o National Science Foundation (CBET-1263455 e CBET-1350240 a G.D.).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
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