切片膜片钳技术是一种有效的方法, 分析学习诱导变化的内在属性和可塑性的兴奋或抑制突触。
片式膜片钳技术是研究特定脑区学习诱发神经可塑性的有力工具。为了分析运动学习诱发的可塑性, 我们训练了大鼠使用加速转子杆任务。老鼠以30秒的间隔执行任务10次, 时间为1或2天。与第一次试验相比, 训练日的表现明显改善。然后, 我们在未经训练和训练的大鼠中, 准备了初级运动皮层 (M1) 的急性脑切片。电流钳分析显示休眠膜电位、穗阈值、afterhyperpolarization 和膜电阻在 II. 层锥体神经元中的动态变化。目前的注射诱导了2天训练的老鼠比未经训练的控制更多的峰值。
为了分析情境学习诱发的可塑性, 我们训练大鼠使用抑制性回避 (IA) 任务。在一个盒子的黑暗面经历了足部震动后, 老鼠学会了躲避它, 呆在明亮的一侧。我们准备了急性海马切片从未经训练的, IA 培训, 不成对, 和 walk-through 鼠。电压钳分析被用来连续记录微型兴奋和抑制突触后电流 (mEPSCs 和 mIPSCs) 从同一 CA1 神经元。在每个 CA1 神经元中, 我们发现了不同的平均 mEPSC 和 mIPSC 振幅, 提示每个神经元在兴奋和抑制突触时有不同的突触后强度。此外, 与未经训练的控制, IA 训练大鼠有较高的 mEPSC 和 mIPSC 振幅, 具有广泛的多样性。这些结果表明, 情境学习创造了突触后的多样性在兴奋和抑制突触在每个 CA1 神经元。
AMPA 或 GABAA受体似乎调解突触后的电流, 因为浴治疗与 CNQX 或荷包阻断 mEPSC 或 mIPSC 事件, 分别。这项技术可以用来研究不同类型的学习在其他地区, 如感觉皮质和杏仁核。
膜片钳技术, 由内尔和 Sakmann 开发, 已被广泛应用于电生理学实验1。整个细胞膜片钳技术2可用于记录细胞内电流或电压使用的 gigaohm 密封的细胞膜。电流钳技术使我们能够分析不同的膜性能, 如休息电位, 电阻, 和电容3。电压钳技术使我们可以分析学习诱导突触可塑性在兴奋和抑制突触。
主要的运动皮层 (M1) 是一个中心地区, 是关键的, 使熟练的志愿运动。先前的电生理学研究表明, 在熟练的运动训练后的第二层/III. 型兴奋性突触中, 长期增增 (分层) 状可塑性的发展4。此外,在体内成像研究进一步证明了 M1 树突棘的重塑后, 一个熟练的到达任务5,6。然而, 学习诱发的突触和内在可塑性并没有在 M1 神经元中表现出来。
我们最近报道, 转子杆任务促进了谷氨酸和 gaba 突触的动态变化, 并改变了 M1 层 II/III 神经元的内在可塑性7。在这里, 我们使用切片膜片钳技术来研究学习诱导的可塑性。这项技术也可以用来研究其他类型的经验依赖的可塑性在其他脑区。例如, 感觉输入到桶皮层可以加强 AMPA 受体介导的兴奋性输入到第二层/III 型神经元8, 和暗示恐惧调理加强兴奋投入到侧杏仁核神经元, 这是必需的恐惧记忆9。此外, 情境学习在兴奋和抑制突触输入海马 CA1 神经元方面产生多样性10,11。
片式膜片钳技术的主要局限性是切片准备中的记录, 这可能无法反映在体内发生的情况。虽然体内的电流钳分析更可靠, 但从技术上来说, 从有意识的动物那里获得足够的数据是很困难的。由于每个锥体神经元具有不同的细胞性质, 需要足够数量的细胞来正确分析神经元在训练后的差异。此外, 电压钳分析需要持续的药物治疗与 CNQX, APV, 或荷包, 以确定后突触反应的性质。为了分析单泡谷氨酸或 GABA 诱发的微小反应, 需要对河豚毒素进行连续处理, 以阻断自发动作电位。虽然最近开发的光子成像技术是强大的分析形态学变化的兴奋性突触19, 需要一个组合膜片钳技术来分析的功能, 突触在体内。目前很难分析抑制突触的形态学变化, 因为大多数抑制突触不会形成棘。在这个时候, 切片膜片钳将是最适合的技术来分析细胞性质或功能的兴奋/抑制突触的训练动物。
使用电流钳分析 (图 4), 我们最近报告了运动学习诱导的内在可塑性的第二层/III 型神经元。具体地说, 1 天训练的大鼠表现出的休眠膜电位明显下降, 穗阈值增加。经过2天训练的大鼠, 休眠膜电位明显增加, 导致兴奋性增加。这些结果提示, 训练大鼠 M1 层 II/III. 型神经元的内在可塑性有动态变化。另外的电压钳分析显示在1天训练的大鼠中, 配对脉冲比的增加, 这表明在前 GABA 释放概率中有一个短暂的下降7。因此, 抑制在二/III 层突触中的 GABA 可能触发由此产生的 M1 的学习诱导可塑性。为了支持这一点, M1 的切片制备需要使用 GABAa受体阻滞剂来诱导20。
微型突触后电位的分析是一种强有力的方法, 以检测突触可塑性的 IA 训练动物。单 CA1 神经元的 mEPSCs 和 mIPSCs 的序贯记录可以分析每个神经元的突触兴奋/抑制强度。由于一个单一的我 (i) psc 的反应是归因于一个单一的泡谷氨酸或 GABA, 增加在我 (i) psc 振幅建议后突触强化。使用我 (I) PSC 分析, 我们发现每个 CA1 神经元的兴奋/抑制输入强度的个体差异 (图 5C)。IA 训练明显促进了突触强度的多样性, 但其他组未观察到这一点 (表 5)。
学习诱导的突触多样性可以从数学上进行分析。通过计算每个点的外观概率, 利用克劳德 e. 香农21的信息论, 可以将每个神经元的数据转换为 self-entropy (位)。一个点以高出现可能性 (在平均水平附近) 表明低 self-entropy, 而一个点以非常罕见的可能性 (一个偏离点) 表明高 self-entropy。与未训练的大鼠相比, 在 IA 训练的大鼠中, 每个神经元的 self-entropy 明显增加, 但不是未配对或 walk-through 大鼠22。这一分析表明, 在语境学习之后, intra-CA1 信息的增加。
切片膜片钳技术也可用于在侧杏仁核9和感觉经验研究在桶皮层8的线索恐惧条件反射研究。此外, 这种技术可以用于其他各种技术的进一步调查。例如, 病毒介导的绿色荧光蛋白 (GFP) 标记基因传递技术可以与膜片钳技术相结合, 来分析特定分子的功能。此外, 还可以使用逆行示踪剂的局灶显微注射来可视化特定区域的具体神经元。然后, 利用电流钳技术, 可以在可视化神经元23中分析细胞特异特性。此外, 结合双光子激光扫描显微镜与双光子激光 uncaging 的谷氨酸已被用来证明脊柱特异性生长和 “反应在小鼠皮层层 II/III 锥体神经元19。因此, 通过将它与新的化学物质、基因传递和照片操作技术相结合, 改进了切片膜片钳技术。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 Dr. 的 Dr. Thiri 旷野和 Mrs. h. Tsurutani 的技术援助。该项目得到了补助金为青年科学家 (香港和林宏), 科学研究 B (博士), 科学研究 C (博士) 和创新领域 (博士), 从教育部, 文化, 体育, 科学和科学研究部的支持,日本的技术。
Rota-Rod Treadmills | Med Associates Inc. | ENV577 | |
inhibitory avoidance box | Shinano Seisakusho | ||
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | ||
Blade | Nisshin EM Co., Ltd | LC05Z | |
Cardiac perfusion syringe | JMS Co., Ltd | JS-S00S | |
Vibratome | Leica Microsystems | VT-1200 | |
Horizontal puller | Sutter Instrument | Model P97 | |
Microfilm 34 gauge | World Precision Instruments, Inc | MF34G-5 | |
0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
Axopatch–1D amplifier | Axon Instruments | ||
Digidata 1440 AD board | Axon Instruments | ||
pCLAMP 10 software | Axon Instruments | ||
Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
CCD camera | Olympus | U-CMAD3 | |
Camera controller | Hamamatsu Photonics K.K. | C2741 | |
Stimulator | Nihon Kohden | SEN-3301 | |
Isolator | Nihon Kohden | SS-104J | |
Motorized manipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
Micromanipulator | Narishige | NMN-21 | |
Peristaltic Pump | Gilson, Inc | MINIPULS® 3 | |
Glass capillary | Narishige | GD-1.5 | |
Ag/AgCl electrode | World Precision Instruments, Inc | EP4 | |
Slice Anchor | Warner instruments | 64-0252 | |
Stimulus electrode | Unique Medical Co., Ltd | KU201-025B | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection buffer/ artificial CSF |
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NaH2PO4 • 2H2O | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries | 039-00475 | |
MgCl2 • 6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
Choline chloride | Sigma-Aldrich Co. | C7527 | |
Ascorbic acid | Wako Pure Chemical Industries | 190-01255 | |
Pyruvic acid Na | Wako Pure Chemical Industries | 199-03062 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich Co. | 28-1850-5 | |
Glucose | Sigma-Aldrich Co. | 07-0680-5 | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
Intracellular solution | |||
K-Gluconate | Sigma-Aldrich Co. | G4500 | |
HEPES | Wako Pure Chemical Industries | 346-01373 | |
EGTA | Wako Pure Chemical Industries | 348-01311 | |
Na2 ATP | Nacalai Tesque | 01072-24 | |
Na3 GTP | Sigma-Aldrich Co. | G-8877 | |
Na phosphocreatine | Sigma-Aldrich Co. | P-7936 | |
CsMeSO3 | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
CsCl | Wako Pure Chemical Industries | 033-01953 | |
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
Drugs in aCSF | |||
2-Chloroadenosine | Sigma-Aldrich Co. | C5134 | |
Picrotoxin | Sigma-Aldrich Co. | P-1675 | |
Tetrodotoxin | Wako Pure Chemical Industries | 207-15901 | |
CNQX | Sigma-Aldrich Co. | C239 | |
APV | Sigma-Aldrich Co. | A5282 |