Fluorescens in situ hybridisering (FISH) kræves ofte i kombination med histopatologi og molekylær diagnostik for valg af behandling hos personlig medicin. En roman cross-sammenkædning, formalin-fri væv fiksativ, der giver høj kvalitet morfologiske, molekylære og fisk analyser fra den samme prøvemateriale ved tilsætning af en post fiksering skridt før fisk er præsenteret.
Morfologiske vurdering af formalin-fast, paraffin-embedded vævsprøver (FFPE) har været guldstandarden for kræft diagnose i årtier på grund af dens fremragende bevarelse af morfologi. Personlig medicin giver i stigende grad individuelt tilpassede og målrettede behandlinger for karakteriseret individuelle sygdomme aktiveret af kombinerede morfologiske og molekylære analytiske teknologier og diagnostik. Udførelsen af morfologiske og molekylære analyser fra samme FFPE modellen udfordrende på grund af de negative virkninger af formalin på grund af kemiske modifikation og cross-linking af nukleinsyrer og proteiner. Cross-sammenkædning, formalin-fri væv fiksativ er for nylig udviklet til at opfylde begge krav, dvs., at bevare morfologi ligesom FFPE og biomolekyler ligesom cryo-bevarelse. Da fisk er ofte nødvendigt i kombination med histopatologi og molekylær diagnostik, testede vi anvendeligheden af fisk protokoller på væv behandlet med denne nye fiksativ. Vi fandt at formalin efter fiksering af histologiske snit af ikke-cross-sammenkædning, formalin-fri og paraffin-embedded (NCFPE) bryst kræft væv genereret tilsvarende resultater til dem med FFPE væv i human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) FISH analyse. Denne protokol beskriver, hvordan en fisk assay oprindeligt udviklet og valideret for FFPE væv kan bruges til NCFPE væv af en simpel efter fiksering trin af histologiske sektioner.
Personlig medicin er i stigende grad afhængig multi-parameter test involverer morfologiske og molekylære analyser. Formalin fiksering af væv som den gyldne standard giver fremragende morfologiske kvalitet1,2. Dog forstyrrer formalin-induceret kemiske modifikation og cross-linking af proteiner og nukleinsyrer3,4,5 negativt Molekylær analyse6. Disse molekylære ændringer begrænse kvaliteten af nukleinsyrer og proteiner og kan resultere i gen ordne i rækkefølge artefakter7 eller nedsat følsomhed af Polymerasekædereaktionen (PCR)-baseret assays8. Selv om store indsats blev taget til at optimere molekylære test for FFPE væv, er cryo-bevarelsen af væv i generel superior til formalin fiksering, hvilket gør det nødvendigt at opdele vævsprøver for forskellige bevarelse procedurer. For at undgå behovet for cryo-bevarelse til molekylære analyser, en ikke-cross-sammenkædning, formalin-fri Fikseringsvæske, PAXgene væv blev udviklet. Denne kommercielt tilgængelige system består af en fiksering og en stabilisering løsning indeholdende forskellige alkoholer, eddikesyre og et vandopløseligt organisk forbindelse. Korrekt opbevaring af nukleinsyrer, (phospo) proteiner og morfologi, der blev vist i flere undersøgelser6,9,10,11,12,13.
Et bestemt program i kræft diagnose er fisk afsløre en omfattende række kromosomale ændringer, såsom omplantninger, submikroskopiske sletninger og klarlægger 14. Tyve procent af invasiv brystkræft tumorer viser f.eks. forstærkning af human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) gen15,16,17, som er forbundet med dårlig prognose18 ,19. Bestemmelse af HER2 overekspression og forstærkning status i brystkræft af fisk er nødvendig for at vælge patienter for anti-HER2-rettet terapi og er en følgesvend diagnostiske opført af Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. For at muliggøre en bred anvendelse af fisk-baserede følgesvend diagnostik i sundhedsvæsenet, blev assays udviklet og godkendt for FFPE væv.
I en tidligere undersøgelse viste vi, at NCFPE væv ikke kan bruges til fisk-assays, som er blevet godkendt til FFPE væv. Men test af tid række forskellige indlæg fiksering procedurer af NCFPE væv med 4% buffered formaldehyd viste, at bogføre fiksering gange på 18 h eller længere NCFPE væv sektioner opnås tilsvarende resultater til dem med FFPE væv14.
I denne undersøgelse, vi leverer en detaljeret protokol og demonstrere virkningen af cross-sammenkædning, formalin-fri væv fiksering og 24 h 4% buffered formaldehyd efter fiksering på sektioner, der anvendes for HER2 fisk og RNA kvalitet fra den samme primære væv prøvemateriale.
Figur 1: Diagram, der viser trin til fluorescens i situ hybridisering (FISH) og RNA analyse af formalin fast paraffin indlejret (FFPE) og cross-sammenkædning, formalin-gratis fast paraffin indlejret (NCFPE) væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Resultaterne viser to vigtigste resultater. Først, en simpel 24 h SBFS efter fiksering trin af dele skåret fra NCFPE væv er tilstrækkelig til at opnå tilsvarende resultater til dem med FFPE i fisk analyser ved hjælp af fisk assays godkendt til FFPE væv (Se også reference14). Denne protokol har fordelen ved at bruge fisk assays oprindeligt udviklet og godkendt for FFPE uden behov for omfattende fornyelse (f.eks. ved at optimere pre hybridisering betingelser for ikke-cross-linked væv). FISK-protokollen kan bruges præcis som beskrevet i brugsanvisningen.
Mindre ændringer fra manufacturer´s instruktionerne beskrevet i denne protokol (f.eks. væv afsnit diameter og inkubering perioder på deparaffinization trin) resultat fra tidligere tilpasninger, som er eksplicit anbefalet af fabrikanten anvendelse af forskellige vævstyper og fiksering metoder.
Trinnet efter fiksering er kritisk, fordi det kræver en kemisk reaktion tid af 18-24 h, som udvider analyse tid af en dag, men giver mulighed for den samme daglige arbejdsgang, som er udviklet til FFPE væv (figur 1). SBFS er rapporteret at trænge væv med en gennemsnitlig hastighed på 1 mm pr. time22 til 5 mm i 2 h afhængigt af væv type23,24. Den iagttagelse, at kun længere efter fiksering perioder på mere end 18 h kunne ændre egenskaberne for NCFPE til FFPE sektioner, angiver, ikke penetration af fiksativ men den kemiske reaktion tid er afgørende for at opnå de ønskede resultater1 ,14.
For det andet kan resterende NCFPE væv, der ikke bruges til efter fiksering bruges til yderligere molekylære analyser, som biomolekyler er velbevaret. Dette blev demonstreret af real-time reverse transkription PCR (figur 3). Analysen er mere følsom og specifik end elektroferogrammet-afledte RIN værdien (RNA integritet antallet) med hensyn til RNA kvalitet (dvs., kemisk modifikation og opsplitning) til mRNA isoleret fra paraffin-embedded væv8. Kvalitetskontrollen blev begrænset i denne undersøgelse til real-time PCR da uafhængige grupper har vist, at ud over RNA, DNA og proteiner isoleret fra NCFPE kvalitet er bedre end fra FFPE væv 8,9, 13.
Protokollen præsenteret følger, eventuelt (f.eks. SBFS opskrift, fiksering betingelser, RNA kvalitetskontrol, validering), kravene i CEN tekniske specifikationer for pre analytiske procedurer for in vitro- diagnostik (IVD), der er for nylig blevet frigivet af europæiske udvalg af Standardiseringsorganisation (CEN) (f.eks. CEN/TS 16827-1:2015 for RNA-Isolation fra FFPE væv, som refererer til standarden, ISO 15189).
Metoden er begrænset til denne særlige fiksativ. Selv om god bevarelsen af biomolekyler og morfologi ved hjælp af cross-sammenkædning, formalin-gratis fiksativ er blevet præsenteret i flere undersøgelser, er det hovedsagelig anvendes i forskning, men ikke i rutine medicinske anvendelser. En af grundene er at erstatte guldstandarden SBFS fiksering af en anden fiksativ ville kræve en række valideringsundersøgelser som ikke alle protokoller optimeret til FFPE materiale kan bruges til materialer fast med cross-sammenkædning fikseringsmidler. Andre væv fiksering metoder blev ikke testet for protokollens fisk.
Den enkle efter fiksering trin beskrevet i dette manuskript har fordelen ved at bruge IVD godkendt assays, både for FFPE og NCFPE væv.
The authors have nothing to disclose.
Vi takke holdet for laboratorium for Molekylær Patologi på Institut patologi af det medicinske universitet Graz for deres ekspertise og støtte. Desuden, vi takker Iris Kufferath og Daniela Pabst for teknisk bistand, Bernadette Rieger og Sylvia Eidenhammer til behandling af HER2 tilfælde samt Kinga Szurian (patolog) og Tamas Regényi (3DHISTEC). Vi takker Penelope Kungl for korrekturlæsning håndskriftet. Dette arbejde er blevet økonomisk støttet af den kristne Doppler forskningsfond, den østrigske føderale Ministeriet for videnskab, forskning og økonomi og National Foundation for forskning, teknologi og udvikling.
SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany | www.sav-lp.de | FN-200L-4-1 | Tissue fixative |
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada | www.simport.com | M-498 | Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples. |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 765112 | For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER. |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 813150 | Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration |
Merck Millipore, Munich, Germany | www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html | MC1009834000 | Dehydration of tissue samples |
VWR Chemicals, Darmstadt, Germany | https://at.vwr.com | 10293EP | Dehydration of tissue samples |
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria | www.herba-chemosan.at | 2549662 32 | Paraffin used in a tissue processing device |
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria | www.LeicaBiosystems.com | 39602004 | Paraffin embedding medium |
Sanova Diagnostik, Vienna, Austria | www.sanova.at | 5229 | Paraffin embedding instrument for tissues for histology |
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria | www.histocom.info | M 910010 | This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument. |
Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark | www.chem.agilent.com | K802021-2 | Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 73504 | For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 765134 | For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections |
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany | www.zytovision.com | Z-2015-200 | For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples. |
3DHISTEC, Budapest, Hungary | www.3dhistech.com | Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera. | |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4368814 | The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction. |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4367659 | PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons. |
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE | www.thermofisher.com | Ser. Nr. F239 | Spectrophotometer for nucleic acid quantification. |
QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System | www.thermofisher.com | 4485701 | PCR machine, |
Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A | www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order | e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 | Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures. |