Floresans in-situ hibridizasyon (balık), histopatoloji ve moleküler teşhis tedavi kişiselleştirilmiş tıp yelpazesi için birlikte genellikle gereklidir. Balık görüntülenmeden önce izin veren yüksek kaliteli morfolojik, moleküler ve balık analizleri aynı örnek buna ek olarak bir sonrası fiksasyon adım tarafından bir roman çapraz bağlama, formalin ücretsiz doku sabitleştirici.
Formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örneklerinin morfolojik değerlendirme Morfoloji mükemmel onun korunması nedeniyle yıllardır kanser teşhis için altın standart olmuştur. Kişiselleştirilmiş tıp tek tek adapte ve hedeflenen tedavilerin kombine morfolojik ve moleküler analitik teknolojileri ve tanılama tarafından etkin karakterize bireysel hastalıklar için giderek sağlar. Aynı FFPE örnekten morfolojik ve moleküler deneyleri performansını formalin kimyasal değişiklik nedeniyle olumsuz etki nedeniyle zorlu ve proteinler ve nükleik asitler ilişkilendirerek. Bir çapraz bağlama, formalin ücretsiz doku sabitleştirici son zamanlarda geliştirilmiş Yani her iki gereksinimleri yerine getirmek için Morfoloji gibi FFPE ve biomolecules gibi cryo-koruma korumak için. Balık, histopatoloji ve Moleküler Diagnostik birlikte genellikle gereklidir, biz balık dokular ile bu yeni sabitleştirici tedavi protokollerinde uygulanabilirliği test. İnsan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) bu formalin sonrası fiksasyonu sigara-çapraz-bağlantı, formalin ücretsiz histolojik kesitler ve parafin gömülü (NCFPE) meme kanseri oluşturulan doku eşdeğer sonuçlar FFPE doku sahip kişilere bulduk Balık analizi. Bu protokolü nasıl ilk olarak geliştirilen ve FFPE doku için doğrulanmış bir balık tahlil NCFPE dokular için histolojik kesitler bir basit sonrası fiksasyon adım kullanılabileceğini açıklar.
Kişiselleştirilmiş tıp giderek morfolojik ve moleküler doku analizleri içeren çok parametreli testlere dayanmaktadır. Dokuların formalin fiksasyon altın standart olarak mükemmel morfolojik kalite1,2sağlar. Ancak, formalin kaynaklı kimyasal modifikasyon ve proteinler ve nükleik asitler3,4,5 olumsuz cross-linking moleküler analizi6ile etkilemektedir. Bu moleküler değişiklikler kalitesi proteinler ve nükleik asitler sınırlamak ve Gen dizisi eserler7 veya Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) düşük duyarlılık neden olabilir-deneyleri8dayalı. Her ne kadar büyük çabaları moleküler testler FFPE doku için optimize etmek için alınmıştır, cryo-koruma dokuların formalin fiksasyon, doku örnekleri farklı koruma yordamları için bölmek gerekli olduğunun genel üstün mevcuttur. Cryo-koruma moleküler analizleri, bir sigara-çapraz-bağlantı, ihtiyacını önlemek için sabitleştirici, formalin ücretsiz PAXgene doku geliştirilmiştir. Piyasada bulunan bu sistem bir fiksasyon ve farklı alkoller, Asetik asit ve çözünür bir organik bileşik içeren bir istikrar çözüm oluşur. Nükleik asitler, proteinler (phospo) ve Morfoloji uygun korunması çeşitli çalışmalar6,9,10,11,12,13‘ te gösterildi.
Kanser teşhis belirli bir uygulamada kromozom değişikliği, translokasyonlar, submicroscopic silme ve Arttırımlar 14gibi geniş kapsamlı algılama balıktır. Örneğin, invaziv meme kanser tümörleri yüzde yirmisi insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) amplifikasyon göstermek kötü prognoz18 ile ilişkili olan gen15,16,17, ,19. Meme kanseri balık tarafından HER2 overexpression ve amplifikasyon statüsünde belirlenmesi hastalar tedavi anti-HER2-yönetmen için seçmek için gerektiği ve Federal uyuşturucu Derneği (FDA tarafından) (http://www.fda.gov/ listelenen bir tanı arkadaşıdır MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. Balık tabanlı arkadaşı tanılama geniş bir uygulama sağlık bakım sağlamak amacıyla deneyleri geliştirilmiş olup FFPE dokular için onayladı.
Bir önceki çalışmada, NCFPE doku FFPE doku için onaylanmış olan balık deneyleri için kullanılamaz gösterdi. Ancak, farklı yazı fiksasyon işlemler gösterdi ki %4 arabelleğe alınmış formaldehit ile NCFPE dokuların dizi fiksasyon kez 18 h veya daha uzun NCFPE doku bölüm sonrası zaman testin Bu FFPE dokular14ile eşdeğer sonuçlar elde.
Bu çalışmada detaylı bir protokol sağlar ve çapraz bağlama, formalin ücretsiz doku fiksasyon ve 24 h %4 etkisini HER2 balık ve RNA kalitesi aynı birincil doku örnekten için kullanılan bölümleri üzerinde formaldehit sonrası tespit arabelleğe gösterilmektedir.
Şekil 1: Floresans in situ hibridizasyon (balık) ve gömülü parafin sabit formalin (FFPE) ve çapraz bağlantı-RNA analizi için adımları gösteren diyagram, sabit parafin formalin-ücretsiz (NCFPE) dokularda gömülü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Sonuçlar iki önemli bulgular göstermektedir. İlk olarak, bir basit 24 h SBFS sonrası fiksasyon adım NCFPE dokulardan kesilmiş bölümlerin analizlerde (Ayrıca bkz: başvuru14) Balık deneyleri FFPE dokular için onaylı kullanarak balık FFPE sahip kişilere eşdeğer sonuçları elde etmek yeterlidir. Bu iletişim kuralının ilk olarak geliştirilen ve FFPE için kapsamlı yeniden doğrulaması için gerek kalmadan (örneğin, çapraz bağlı doku öncesi hibridizasyon koşullarını optimize ederek) onaylı balık deneyleri kullanmanın avantajı vardır. Balık Protokolü tam olarak üretici talimatlarında açıklandığı gibi kullanılabilir.
Açıkça üretici tarafından önerilen bu Protokolü (örneğin doku bölüm çapı ve kuluçka dönemleri deparaffinization adımlar) sonucu önceki uyarlamaları, açıklanan manufacturer´s yönergeleri gelen küçük değişiklikler farklı doku türlerine ve fiksasyon yöntemleri kullanımı nedeniyle.
18-24 h da bir gün analiz süresini uzatır ancak aynı günlük iş akışı olarak FFPE doku (şekil 1) için geliştirilen bir kimyasal reaksiyon süresi gerektirdiğinden sonrası fiksasyon önemli adımdır. SBFS doku 1 mm saat22 ‘ ye bağlı olarak doku türü23,242 h 5 mm başına ortalama bir oranda nüfuz bildirilmektedir. Sadece sonrası fiksasyon takmaktan daha 18 h FFPE bölümlerine NCFPE özelliklerini değiştirebilir gözlem kimyasal reaksiyon zamanı değil sabitleştirici penetrasyonu istenen sonuçları1 ulaşmak için kritik olduğunu gösterir ,14.
İkinci olarak, biomolecules iyi korunmuş olarak sonrası fiksasyon için kullanılmaz kalan NCFPE doku daha da moleküler analizi için kullanılabilir. Bu gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (şekil 3) tarafından sunuldu. Tahlil daha hassas ve electropherogram elde edilen RIN değer (RNA bütünlük numarası) mRNA parafin gömülü doku8izole için RNA kalite (yani, kimyasal modifikasyon ve parçalanma) ile ilgili olarak daha özel. Bağımsız gruplar RNA ek olarak, DNA ve proteinler NCFPE izole kalitesini FFPE doku 8,9dan, daha iyi olduğunu göstermiştir bu yana kalite kontrol için gerçek zamanlı PCR bu çalışmada sınırlı idi 13.
Aşağıdaki gibi uygun olan yerlerde sunulan Protokolü (örneğin, SBFS tarifi, fiksasyon şartları, RNA kalite kontrol, doğrulama), CEN teknik özellikleri için In vitro diagnostics (IVD), önceden analitik işlemleri için gereksinimleri hangi son zamanlarda serbest bırakılmış Avrupa Komitesi, standardizasyon (CEN tarafından) (örneğin CEN/TS 16827-RNA izolasyonu için 1:2015 FFPE dokulara gelen ISO 15189 standardına anlamına gelir).
Bu belirli sabitleştirici sınırlı bir yöntemdir. Biomolecules ve çapraz bağlama, formalin ücretsiz sabitleştirici kullanarak Morfoloji iyi korunması çeşitli çalışmalarda sunulan rağmen temelde araştırma ama rutin tıbbi uygulamalar içinde kullanılır. FFPE malzeme için en iyi duruma getirilmiş tüm iletişim kuralları ile çapraz bağlama Fiksajlar sabit malzeme için kullanılabilir olarak altın standart SBFS yerine başka bir sabitleştirici tarafından fiksasyon doğrulama çalışmaları çeşitli gerektirecek bir nedenidir. Diğer doku fiksasyon yöntemleri bu balık iletişim kuralı için test değil.
Bu el yazması açıklanan basit sonrası fiksasyon adım onaylı IVD deneyleri için FFPE ve NCFPE doku kullanmanın avantajı vardır.
The authors have nothing to disclose.
Tıp Üniversitesi Graz için kendi uzmanlık patolojinin Enstitüsü, Moleküler Patoloji Laboratuvarı takım teşekkür ediyoruz ve destek. Ayrıca, biz Iris Kufferath ve Daniela Pabst teknik destek için Bernadette Rieger ve Sylvia HER2 servis taleplerini işlemek için Eidenhammer yanı sıra Kinga Szurian (patolog) ve Tamas Regényi (3DHISTEC) teşekkür ederim. Biz Penelope Kungl el yazması proofreading için teşekkür ederim. Bu eser mali Christian Doppler Araştırma Fonu, Avusturya Federal Bilim Bakanlığı, araştırma ve Ekonomi ve Ulusal Vakfı araştırma, teknoloji ve geliştirme için desteklenmiştir.
SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany | www.sav-lp.de | FN-200L-4-1 | Tissue fixative |
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada | www.simport.com | M-498 | Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples. |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 765112 | For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER. |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 813150 | Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration |
Merck Millipore, Munich, Germany | www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html | MC1009834000 | Dehydration of tissue samples |
VWR Chemicals, Darmstadt, Germany | https://at.vwr.com | 10293EP | Dehydration of tissue samples |
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria | www.herba-chemosan.at | 2549662 32 | Paraffin used in a tissue processing device |
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria | www.LeicaBiosystems.com | 39602004 | Paraffin embedding medium |
Sanova Diagnostik, Vienna, Austria | www.sanova.at | 5229 | Paraffin embedding instrument for tissues for histology |
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria | www.histocom.info | M 910010 | This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument. |
Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark | www.chem.agilent.com | K802021-2 | Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 73504 | For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections |
Qiagen GmbH, Hilden Germany | www.qiagen.com | 765134 | For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections |
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany | www.zytovision.com | Z-2015-200 | For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples. |
3DHISTEC, Budapest, Hungary | www.3dhistech.com | Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera. | |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4368814 | The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction. |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4367659 | PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons. |
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE | www.thermofisher.com | Ser. Nr. F239 | Spectrophotometer for nucleic acid quantification. |
QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System | www.thermofisher.com | 4485701 | PCR machine, |
Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A | www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order | e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 | Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures. |