Induktion und Diagnose von Tumoren in<em> Drosophila</em> Imaginal Disc Epithelia
Summary
Mosaik Klonanalyse in Drosophila imaginären Scheibenepithelien ist ein leistungsfähiges Modellsystem, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von Tumoren in Drosophila Flügel imaginären Scheiben mit dem GAL4-UAS-System, und führen Sie eine Diagnose-Methode, um die Tumor-Phänotypen zu klassifizieren.
Abstract
In den frühen Stadien des Krebses zeigen transformierte mutierte Zellen zytologische Anomalien, beginnen unkontrollierte Überwucherung und zerstören die Gewebeorganisation schrittweise. Drosophila melanogaster hat sich als ein populäres experimentelles Modellsystem in der Krebsbiologie entwickelt, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu untersuchen. Insbesondere genetische Werkzeuge für Drosophila- Imagialscheiben (Entwicklung von Epithelien in Larven) ermöglichen die Entstehung von transformierten Pro-Tumor-Zellen innerhalb eines normalen Epithelgewebes, eine Situation ähnlich der Anfangsphase des menschlichen Krebses. Eine neuere Studie der Tumorentstehung in Drosophila- Flügel-Imaginalscheiben zeigte jedoch, dass die Tumorinitiierung von der gewebe-intrinsischen Cytoarchitektur und der lokalen Mikroumgebung abhängt, was darauf hindeutet, dass es wichtig ist, die regionsspezifische Anfälligkeit für tumorigene Reize bei der Bewertung von Tumor-Phänotypen im imaginären Bereich zu berücksichtigen Scheiben Zur Erleichterung der phänotypischen Analyse von Tumor progressiIn imaginären Scheiben beschreiben wir hier ein Protokoll für genetische Experimente mit dem GAL4-UAS-System, um neoplastische Tumore in Flügel-imaginären Scheiben zu induzieren. Wir stellen ferner eine Diagnosemethode vor, um die Phänotypen von in imaginären Epithelien induzierten klonalen Läsionen zu klassifizieren, da eine klare Klassifizierungsmethode zur Unterscheidung verschiedener Stadien der Tumorprogression (wie Hyperplasie, Dysplasie oder Neoplasie) bisher nicht beschrieben wurde. Diese Methoden können weitgehend auf die Klonanalyse von Tumor-Phänotypen in verschiedenen Organen in Drosophila anwendbar sein.
Introduction
Epithelgewebe sind hoch organisierte Systeme, die die bemerkenswerte homöostatische Fähigkeit haben, ihre Organisation durch Entwicklung und Zellumsatz zu erhalten. Dieses robuste Selbstorganisationssystem wird jedoch während der Tumorentwicklung zunehmend unterbrochen. Zu Beginn der Tumorentwicklung treten einzelne Mutantenzellen aus der Onkogenaktivierung oder der Tumor-Suppressor-Gen-Inaktivierung innerhalb einer Epithelschicht auf. Wenn diese transformierte "Pro-Tumor-Zelle" einer unterdrückenden Umgebung entzieht, die Epithelorganisation stört und unkontrollierte Proliferation beginnt, tritt die Tumorentstehung auf 1 . In den vergangenen Jahrzehnten haben herausragende technologische Fortschritte in der Genetik und Molekularbiologie bemerkenswerte Fortschritte bei der Krebsforschung gemacht. Insbesondere wurden neuere Studien unter Verwendung der genetischen Mosaikanalyse-Werkzeuge in Drosophila melanogaster , wie FLP-FRT (Flippase-Rekombinase / Flippase-Rekombinase-Target) mitotisches RekombinatAtion 2 und Flip-out-GAL4-UAS (Upstream-Aktivierungssequenz) -Systeme 3 haben wesentlich dazu beigetragen, die genetischen Mechanismen der Bildung und Metastasierung der Tumore 4 , 5 , 6 besser zu verstehen.
Untersuchungen einer Gruppe konservierter Drosophila- Tumor-Suppressor-Gene, tödlicher Riesen-Larven ( lgl ), Scheiben groß ( dlg ) und Scribble ( Scrib ), unterstrichen die kritische Beziehung zwischen dem Verlust der Epithelorganisation und der Tumorentwicklung, da diese Gene eine Schlüsselrolle spielen In Regulation der apikalen Basalzellpolarität und Zellproliferation in Epithelgeweben 7 . Während Drosophila- Imagialscheiben normalerweise monolayered Epithelien sind, verursachen homozygote Mutationen in einem dieser drei Gene Zellen zu verlieren Struktur und Polarität, nicht zu unterscheidenVermietung, überproliferieren und letztlich mehrschichtige amorphe Massen bilden, die mit angrenzenden Geweben verschmelzen 7 . Ebenso ist die Störung dieser Gene bei Säugetieren an der Entwicklung von bösartigen Tumoren beteiligt 8 , 9 . Die neoplastischen Phänotypen, die von den mutierten Geweben gezeigt wurden, führten zur Klassifizierung dieser drei Gene als konservierte, neoplastische Tumorsuppressorgene (nTSGs) 7 , 8 . Wenn jedoch homozygote nTSG-Mutantenzellen sporadisch bei der Entwicklung von Wildtyp-Imagialscheiben unter Verwendung von FLP-FRT-vermittelter mitotischer Rekombination erzeugt werden, werden mutierte Zellen aus dem Gewebe durch c-Jun-N-terminale Kinase (JNK) -abhängige Apoptose 10 , 11 eliminiert , 12 , 13 , 14 , Extrusion 15 </suP> , 16 oder Engagierung und Phagozytose durch Nachbarn 17 . In diesen genetisch mosaischen Epithelien wird die Apoptose meist in nTSG-Mutantenzellen, die sich an der Klongrenze befinden, nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass benachbarte normale Zellen die Apoptose der nTSG-Mutantenzellen 10 , 11 , 12 , 18 auslösen. Jüngste Studien in Säugetierzellen haben bestätigt, dass diese zellwettbewerbsabhängige Eliminierung von Pro-Tumor-Zellen ein evolutionär konservierter epithelialer Selbstverteidigungsmechanismus gegen Krebs ist. 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Eine neuere Studie in Drosophila- Imagialscheiben zeigte jedoch, dass Mosaik-NTSG-Knockdown-Klone neoplastische Tumore induzierenIc Bereiche von Flügel imaginären Scheiben 16 . Die anfängliche Tumorbildung fand sich immer in der peripheren "Scharnierregion" und wurde niemals im zentralen "Beutel" -Bereich des Flügelscheibenepithels beobachtet, was darauf hindeutet, dass das tumorigene Potential der nTSG-Knockdown-Zellen von der lokalen Umgebung abhängt. Der zentrale Beutelbereich fungiert als "Tumor-Kaltfleck", wo Pro-Tumor-Zellen keine dysplastische Überwucherung zeigen, während sich die periphere Scharnierregion wie ein "Tumor-Hotspot" 16 verhält. In "Kaltfleck" Beutelregionen delaminieren nTSG-Knockdown-Zellen von der Basalseite und unterziehen sich der Apoptose. Im Gegensatz dazu, als "Hotspot" Scharnierzellen besitzen ein Netzwerk von robusten zytoskeletalen Strukturen auf ihren basalen Seiten, nTSG-Knockdown-Zellen delaminieren von der apikalen Seite des Epithels und initiieren tumorigene Überwucherung 16 . Daher erfordert die Analyse von Tumor-Phänotypen in imaginären Scheiben sorgfältige consiVerringerung der regionsspezifischen Anfälligkeit für tumorigene Reize.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion der neoplastischen Tumorbildung in den Drosophila- Flügel-Imaginalscheiben unter Verwendung des GAL4-UAS- RNAi- Systems, durch das nTSG-Knockdown-Zellen in normalen Flügelscheibenepithelien erzeugt werden. Obwohl diese experimentellen Systeme nützlich sind, um die frühen Stadien von Krebs zu untersuchen, wurde eine eindeutige Klassifizierungsmethode zur Bewertung der Stadien der Tumorprogression in imaginären Scheibenepithelien bisher nicht klar beschrieben. Daher schlagen wir auch eine Diagnosemethode vor, um pro-Tumor-Klon-Phänotypen, die in den Flügelscheibenepithelien induziert werden, in drei Kategorien zu klassifizieren: Hyperplasie (Akkumulation einer übermäßigen Anzahl von normal erscheinenden Zellen mit erhöhter Proliferation), Dysplasie (prämalignes Gewebe, das aus ungewöhnlich erscheinendem zusammengesetzt ist Zellen) und Neoplasien (gutartiger oder bösartiger Tumor aus Zellen mit abnormalem Aussehen und abnormalem Proliferationsmuster).
Protocol
Representative Results
Discussion
Das GAL4-UAS-System ist eines der leistungsstärksten genetischen Werkzeuge für die gezielte Genexpression in Drosophila 26 und erleichtert die Injektion und Analyse von Tumorzellen in vivo 4 . Dieses System ermöglicht die Erzeugung von Klonen, die den Knockdown von Tumorsuppressorgenen oder die Überexpression von Onkogenen im Wildtyp-Epithelgewebe tragen, eine Situation, die den Anfangsstadien des menschlichen Krebses sehr ähnlich ist, wo transformie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken J. Vaughen für kritisches Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 und The Takeda Science Foundation Research Grant zu YT
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
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