종양의 유도 및 진단<em> Drosophila</em> 상피 디스크 상피 세포
Summary
Drosophila imaginal disc epithelia의 모자이크 클론 분석은 종양 형성의 유전 및 세포 메커니즘을 연구하는 강력한 모델 시스템입니다. 여기에서는 GAL4-UAS 시스템을 사용하여 Drosophila wing imaginal discs에서 종양을 유도하는 프로토콜을 설명하고 종양 표현형을 분류하는 진단 방법을 소개합니다.
Abstract
암의 초기 단계에서, 형질 전환 된 돌연변이 세포는 세포 학적 이상을 보이고 통제되지 않은 과증식을 시작하며 점차적으로 조직 구성을 붕괴시킵니다. Drosophila melanogaster 는 종양 형성의 유전 및 세포 메커니즘을 연구하기 위해 암 생물학에서 대중적인 실험 모델 시스템으로 부상했습니다. 특히 Drosophila imaginal disc (애벌레의 상피 형성)를위한 유전 도구는 인간 상피 세포의 초기 단계와 유사한 상황 인 정상 상피 조직 내에서 형질 전환 된 종양 세포의 생성을 가능하게합니다. 그러나 Drosophila wing imaginal disc의 종양 발생에 관한 최근의 연구에 따르면, 종양 발생은 조직 고유의 세포 구조와 국소 미세 환경에 달려있어 상상적으로 종양 표현형을 평가할 때 종양 형성 자극에 대한 영역 특이성 감수성을 고려하는 것이 중요하다는 것을 알 수있다 디스크. 종양 진행의 표현형 분석을 용이하게하기 위해GAL4-UAS 시스템을 이용하여 날개 상상 디스크에서 종 양성 종양을 유도하는 유전자 실험 프로토콜을 설명합니다. 우리는 상피 성 상피에서 유도 된 클론 병변의 표현형을 분류하기위한 진단 방법을 소개한다. 종양 진행의 다양한 단계 (과형성, 이형성증, 신 생물 등)를 구분하기위한 분명한 분류 방법은 이전에 기술되지 않았다. 이러한 방법은 Drosophila의 여러 기관에서 종양 phenotypes의 클론 분석에 널리 적용 할 수 있습니다.
Introduction
상피 조직은 발달 및 세포 회전율을 통해 조직을 유지할 수있는 현저한 항상성을 지닌 고도로 조직화 된 시스템입니다. 그러나이 강력한자가 조직 시스템은 종양 발달 중에 점차적으로 혼란을 겪습니다. 종양 발달 초기에, 종양 유전자 활성화 또는 종양 억제 유전자 불 활성화로 인해 발생하는 개개의 돌연변이 세포가 상피층 내에서 출현한다. 이 형질 전환 된 "종양 세포"가 억제 환경을 피하고, 상피 조직을 파괴하고, 제어되지 않은 증식을 시작할 때, 종양 형성이 발생합니다 1 . 지난 수십 년 동안 유전학 및 분자 생물학 분야의 탁월한 기술 발전은 암 연구에서 눈부신 발전을 이루었습니다. 특히, FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase 표적) 유사 분열 재조합과 같은 Drosophila melanogaster 에서 유 전적으로 모자이크 분석 도구를 사용한 최근의 연구2 및 플립 – GAL4 – UAS (업스트림 활성화 시퀀스) 시스템 3 , 종양의 형성과 전이에 관련된 유전자 메커니즘을 이해하는 데 크게 기여했습니다 4 , 5 , 6 .
치명적인 자이언트 애벌레 ( lgl ), 큰 디스크 ( dlg ) 및 낙서 ( scribble )와 같은 보존 된 Drosophila 종양 억제 유전자 그룹에 대한 연구는 상피 조직 손실과 종양 발달 사이의 중요한 관계를 강조했습니다. apical-basal cell의 극성과 상피 조직에서의 세포 증식의 조절 7 . Drosophila imaginal disc는 일반적으로 단층 상피 세포이지만,이 3 가지 유전자 중 homozygous 돌연변이는 세포가 구조와 극성을 잃게하고,overproliferate, rentiate 궁극적 인접 조직 7 융합 다층 비정질 덩어리를 형성한다. 마찬가지로, 포유 동물에서 이들 유전자의 파괴는 악성 종양의 발병과 관련이있다 8 , 9 . 돌연변이 조직에 의해 나타나는 종양 표현형은 보존, 종양 종양 억제 유전자 (nTSGs)와 같은 세 가지 유전자의 분류 7, 8로 이어졌다. 그러나 homozygous nTSG 돌연변이 세포가 FLP-FRT 매개 성의 유사 분열 재조합을 사용하여 야생 형 상상 원판을 개발할 때 산발적으로 생성되면 c-Jun N-terminal kinase (JNK) 의존성 세포 사멸을 통해 돌연변이 세포가 조직에서 제거됩니다 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 압출 15 </sup> , 16 , 또는 이물질에 의한 황산 화 및 식균 작용 17 . 이 유 전적으로 모자이크 상피 세포에서는 세포 경계가 클로닝 경계에 위치한 nTSG 돌연변이 세포에서 주로 검출되며, 이는 인접한 정상 세포가 nTSG 돌연변이 세포의 세포 사멸을 유발한다는 것을 의미합니다. 10 , 11 , 12 , 18 . 포유 동물 세포에 대한 최근의 연구에 따르면 전구 세포 종양 세포의이 세포 경쟁 의존적 제거가 암에 대한 진화 적으로 보존 된 상피 세포 방어 기작임을 확인했다 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
그러나 Drosophila imaginal discs에 대한 최근 연구에서 모자이크 nTSG-knockdown clone은 종양의 종양을 특이 적으로 유도한다는 것을 보여 주었다날개의 상상의 디스크의 IC 영역 16 . 초기 종양 형성은 말초 "힌지"영역에서 항상 발견되었고 날개 디스크 상피의 중앙 "파우치 (pouch)"영역에서는 관찰되지 않았으며, 이는 nTSG- 녹다운 세포의 종양 형성 잠재력이 국소 환경에 의존한다는 것을 암시한다. 중앙 파우치 지역은 전립선 종양 세포가 이형성 과증식을 나타내지 않는 반면 말초 경첩 부위는 "종양 핫스팟" 16 처럼 행동하는 "종양 냉점"으로 기능합니다. "coldspot"파우치 영역에서 nTSG- 녹다운 세포는 기저부로부터 박리되어 세포 사멸을 겪습니다. 대조적으로 "핫스팟"힌지 셀들이 기저 측면에 견고한 골격 구조의 네트워크를 갖고, nTSG-녹다운 세포는 상피의 선단 측으로부터 박리 및 발암 성 과증식 (16)을 시작. 따라서, 상상의 디스크에서 종양 phenotypes의 분석은주의 consin 필요합니다종양 형성 자극에 대한 부위 특이 적 감수성의 저하.
여기, 우리는 정상 날개 디스크 상피에서 nTSG – knockdown 세포가 생성되는 GAL4 – UAS – RNAi 시스템을 활용하여 초파리 날개 imaginal 디스크에 종양 형성을 유도하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 실험 시스템이 암의 초기 단계를 연구하는 데 유용하지만 상상 디스크 상피 세포에서 종양 진행 단계를 평가하는 명확한 분류 방법은 이전에 명확하게 설명되지 않았습니다. 따라서 우리는 또한 날개 원발성 상피 세포에서 유래 된 전 종양의 클론 성 표현형을 3 가지 범주로 분류하는 진단 방법을 제안한다 : 증식 (증가 된 증식으로 정상 출현하는 세포의 과도한 수의 축적), 이형성증 (비정상적으로 나타나는 전암 조직 세포) 및 신 생물 (비정상적인 모양 및 비정상적인 증식 패턴을 갖는 세포로 구성된 양성 또는 악성 종양).
Protocol
Representative Results
Discussion
GAL4-UAS 시스템은 초파리 (26) 내의 표적 유전자의 발현을위한 가장 강력한 유전 적 도구이다 크게 생체 4 종양 세포 유도 분석을 용이하게한다. 이 시스템은 변형 된 종양 세포가 정상 상피 세포로 둘러싸인 인간 암의 초기 단계와 매우 유사한 상황 인 야생형 상피 조직 내 종양 억제 유전자의 knockdown 또는 종양 유전자의 과발현을 나타내는 클론의 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고를 비판적으로 읽었던 J. Vaughen에게 감사드립니다. 이 연구는 JSPS 가신 교부금 번호 26891025, 15H01500 및 YT에 대한 다케다 과학 재단 연구 보조금의 교부금으로 지원되었습니다
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
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