Mosaisk klonanalyse i Drosophila imaginal disc epithelia er et kraftig modellsystem for å studere de genetiske og cellulære mekanismene til tumorigenese. Her beskriver vi en protokoll for å indusere svulster i Drosophila- vinge-imaginale plater som bruker GAL4-UAS-systemet, og introdusere en diagnosemetode for å klassifisere tumorfenotyper.
I de tidlige stadier av kreft viser transformerte mutantceller cytologiske abnormiteter, begynner ukontrollert overvekst og gradvis forstyrrer vevsorganisasjon. Drosophila melanogaster har dukket opp som et populært eksperimentelt modellsystem i kreftbiologi for å studere de genetiske og cellulære mekanismene til tumorigenese. Spesielt gjør genetiske verktøy for Drosophila imaginale plater (utvikler epithelia i larver) opprettelsen av transformerte pro-tumorceller i et normalt epitelvev, en situasjon som ligner på de første stadier av menneskelig kreft. En nylig studie av tumorigenese i Drosophila- vinge-imaginale plater viste imidlertid at svulstinitiasjon avhenger av vevsintrinsisk cytoarkitektur og lokal mikromiljø, noe som tyder på at det er viktig å vurdere regionsspesifikk følsomhet for tumorigeniske stimuli ved evaluering av tumorfenotyper i imaginal plater. For å lette fenotypisk analyse av tumorprogresiPå imaginal plater, her beskriver vi en protokoll for genetiske eksperimenter som bruker GAL4-UAS-systemet for å indusere neoplastiske svulster i vinge-imaginale plater. Vi presenterer videre en diagnosemetode for å klassifisere fenotyper av klonale lesjoner indusert i imaginal epithelia, da en klar klassifiseringsmetode for å diskriminere ulike stadier av svulstprogresjon (for eksempel hyperplasi, dysplasi eller neoplasi) ikke hadde blitt beskrevet tidligere. Disse metodene kan være bredt anvendbare for klonanalysen av tumorfenotyper i forskjellige organer i Drosophila .
Epiteliale vev er høyt organiserte systemer som har den bemerkelsesverdige homeostatiske evnen til å opprettholde sin organisasjon gjennom utvikling og celleomsetning. Dette robuste selvorganiserende systemet blir imidlertid gradvis forstyrret under tumorutvikling. Ved begynnelsen av tumorutvikling, oppstår individuelle mutantceller som oppstår ved onkogenaktivering eller tumor-suppressor-geninaktivering i et epitelskjema. Når denne transformerte "pro-tumorcellen" unngår et undertrykkende miljø, forstyrrer epithelial organisasjon, og begynner ukontrollert proliferasjon, forekommer tumorigenese 1 . De siste teknologiske fremskritt innen genetikk og molekylærbiologi har de siste tiårene gjort bemerkelsesverdige fremskritt på kreftforskning. Spesielt har nyere studier ved hjelp av genetisk mosaikkanalyseværktøy i Drosophila melanogaster , som FLP-FRT (flippase rekombinase / flippase rekombinase target) mitotisk recombinAtion 2 og flip-out-GAL4-UAS (oppstrøms aktiverende sekvens) systemer 3 har i stor grad bidratt til bedre forståelse av de genetiske mekanismene som er involvert i dannelsen og metastasen av tumorer 4 , 5 , 6 .
Studier av en gruppe konserverte Drosophila- svulster-suppressor-gener, dødelige gigantiske larver ( lgl ), plater store ( dlg ) og scribble ( scrib ), fremhevet det kritiske forholdet mellom tap av epitelorganisering og tumorutvikling, da disse gener spiller sentrale roller I regulering av apikal-basalcellepolaritet og celleproliferasjon i epitelvev 7 . Mens Drosophila- imaginale plater vanligvis er monolagert epitel, vil homozygote mutasjoner i noen av disse tre genene føre til at celler mister struktur og polaritet, mislykkes i å diffeLeie, overproliferere og til slutt danne flerlags amorfe masser som smelter sammen med tilstøtende vev 7 . På samme måte er forstyrrelse av disse gener i pattedyr involvert i utviklingen av ondartede svulster 8 , 9 . De neoplastiske fenotyper utstilt av mutantvevet har ført til klassifisering av disse tre gener som konserverte neoplastiske svulster-suppressorgener (nTSG'er) 7 , 8 . Når homozygote nTSG-mutantceller sporadisk genereres ved utvikling av vildtype-imaginale plater med bruk av FLP-FRT-mediert mitotisk rekombinasjon, blir mutantceller eliminert fra vevet gjennom c-Jun N-terminale kinase (JNK) -avhengig apoptose 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , ekstrudering 15 </suP> , 16 eller engulfment og fagocytose av naboer 17 . I denne genetisk mosaikkepitel er apoptose for det meste detektert i nTSG-mutante celler lokalisert ved klongrensen, noe som antyder at tilstøtende normale celler utløser apoptosen av nTSG-mutantceller 10 , 11 , 12 , 18 . Nylige studier i pattedyrceller har bekreftet at denne cellekonkurranseavhengige eliminering av pro-tumorceller er et evolusjonært konservert epitelisk selvforsvarsmekanisme mot kreft 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
En nylig studie i Drosophila imaginale plater viste imidlertid at mosaikk nTSG-knockdown kloner induserer neoplastiske svulster i spesifikkIc regioner av vinge imaginal plater 16 . Initial tumorformasjon ble alltid funnet i det perifere "hengsel" -området og aldri observert i den sentrale "pose" -regionen på vingeskiveepitelet, noe som tyder på at det tumoregeneriske potensialet for nTSG-knockdown-celler avhenger av lokalt miljø. Den sentrale pose regionen fungerer som en "tumor coldspot" hvor pro-tumor celler ikke viser dysplastisk overvekst, mens den perifere hengsel regionen oppfører seg som en "tumor hotspot" 16 . I "coldspot" -poseregioner delaminerer nTSG-knockdown-celler fra basalsiden og gjennomgår apoptose. I motsetning til at "hotspot" hengselceller har et nettverk av robuste cytoskeletale strukturer på deres basale sider, delaminerer nTSG-knockdown-celler fra apitelens epikale side og initierer tumorigenisk overvekst 16 . Derfor krever analyse av tumorfenotyper i imaginale plater nøye konsistensAvledning av den regionspesifikke følsomheten for tumorigeniske stimuli.
Her beskriver vi en protokoll for å indusere neoplastisk svulstdannelse i Drosophila- vinge-imaginale plater som benytter GAL4-UAS- RNAi- systemet ved hjelp av hvilke nTSG-knockdown-celler genereres i normal vingeskive epithelia. Selv om disse eksperimentelle systemene er nyttige for å studere de tidlige stadier av kreft, er det ikke klart beskrevet en klar klassifiseringsmetode for å evaluere stadiene av svulstprogresjon i imaginal disc epithelia. Derfor foreslår vi også en diagnosemetode for å klassifisere pro-tumor-klonale fenotyper indusert i vingeskiveepitelene i tre kategorier: hyperplasi (akkumulering av et overdreven antall normalt fremkomne celler med økt proliferasjon), dysplasi (premalignert vev sammensatt av unormalt forekommende Celler) og neoplasi (godartet eller ondartet svulst sammensatt av celler som har et unormalt utseende og unormalt proliferasjonsmønster).
GAL4-UAS-systemet er et av de kraftigste genetiske verktøyene for målrettet genuttrykk i Drosophila 26, og i stor grad letter tumorinduksjon og analyse in vivo 4 . Dette systemet muliggjør generering av kloner som bærer knockdown av tumor-suppressor-gener eller overekspresjon av onkogener innen vildtype epitelvev, en situasjon som er svært lik de innledende stadier av menneskelig kreft hvor transformerte pro-tumorceller er omgitt av normale epitelcel…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker J. Vaughen for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 og The Takeda Science Foundation Research Grant til YT
Reagents | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
normal goat serum | Sigma | G6767 | |
mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly strains | |||
sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |