Induktion og diagnose af tumorer i<em> Drosophila</em> Imaginal Disc Epithelia
Summary
Mosaik klonanalyse i Drosophila imaginal disc epithelia er et kraftfuldt model system til at studere tumoregenesens genetiske og cellulære mekanismer. Her beskriver vi en protokol til at fremkalde tumorer i Drosophila- vinge-imaginale diske ved hjælp af GAL4-UAS-systemet og indføre en diagnosemetode til klassificering af tumorfænotyperne.
Abstract
I de tidlige stadier af kræft viser transformerede mutante celler cytologiske abnormiteter, begynder ukontrolleret overvækst og gradvist forstyrrer vævsorganisation. Drosophila melanogaster er opstået som et populært eksperimentelt modelsystem i kræftbiologi for at studere tumoregenesens genetiske og cellulære mekanismer. Især aktiverer genetiske værktøjer til Drosophila imaginale diske (udviklende epithelier i larver) skabelsen af transformerede pro-tumorceller inden for et normalt epithelvæv, en situation svarende til de indledende stadier af menneskelig cancer. En nylig undersøgelse af tumorigenese i Drosophila- vinge-imaginale diske viste imidlertid, at tumorinitiering afhænger af den vævsintrinsiske cytoarkitektur og det lokale mikromiljø, hvilket tyder på, at det er vigtigt at overveje den regionspecifikke modtagelighed for tumorigeniske stimuli ved evaluering af tumorfænotyper i imaginal diske. At lette fænotypisk analyse af tumorprogressiPå imaginal diske, her beskriver vi en protokol for genetiske eksperimenter ved hjælp af GAL4-UAS-systemet til at fremkalde neoplastiske tumorer i vinge-imaginale diske. Vi introducerer yderligere en diagnosemetode til klassificering af fænotyper af klonale læsioner induceret i imaginal epithelia, da en klar klassificeringsmetode til at diskriminere forskellige stadier af tumorprogression (såsom hyperplasi, dysplasi eller neoplasi) ikke tidligere var beskrevet. Disse metoder kan være bredt anvendelige til klonanalysen af tumorfænotyper i forskellige organer i Drosophila .
Introduction
Epitelvæv er højt organiserede systemer, der har den bemærkelsesværdige homeostatiske evne til at opretholde deres organisation gennem udvikling og celleomsætning. Dette robuste selvorganiserende system forstyrres imidlertid progressivt under tumorudvikling. Ved begyndelsen af tumorudvikling fremkommer individuelle mutantceller, der opstår ved onkogenaktivering eller tumor-suppressor gen inaktivering inden for et epithelialag. Når denne transformerede "pro-tumorcelle" undgår et undertrykkende miljø, forstyrrer epitelorganisationen og begynder ukontrolleret proliferation, forekommer tumorigenese 1 . I løbet af de sidste par årtier har udestående teknologiske fremskridt inden for genetik og molekylærbiologi gjort bemærkelsesværdige fremskridt med kræftforskning. Specielt har nyere undersøgelser, der anvender de genetisk mosaiske analyseværktøjer i Drosophila melanogaster , såsom FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase target) mitotisk recombinAtion 2 og flip-out-GAL4-UAS (opstrøms aktiverende sekvens) systemer 3 har i høj grad bidraget til bedre forståelse af de genetiske mekanismer involveret i dannelsen og metastasen af tumorer 4 , 5 , 6 .
Undersøgelser af en gruppe af konserverede Drosophila- tumor-suppressor-gener, dødbringende larver ( lgl ), diske store ( dlg ) og scribble ( scrib ) fremhævede det kritiske forhold mellem tab af epithelial organisation og tumorudvikling, da disse gener spiller nøgleroller I regulering af apisk-basalcellepolaritet og celleproliferation i epitelvæv 7 . Mens Drosophila imaginale diske normalt er monolagede epithelia, forårsager homozygote mutationer i et hvilket som helst af disse tre gener celler at tabe struktur og polaritet, undlader at diffeLeje, overproliferere og til sidst danne flerlags amorfe masser, der smelter sammen med tilstødende væv 7 . Tilsvarende er forstyrrelse af disse gener i pattedyr involveret i udviklingen af ondartede tumorer 8 , 9 . De neoplastiske fænotyper udstillet af de mutante væv har ført til klassificeringen af disse tre gener som konserverede neoplastiske tumor-suppressor gener (nTSG'er) 7 , 8 . Når homozygote nTSG-mutante celler imidlertid sporadisk genereres i udvikling af vildtype-imaginale diske ved anvendelse af FLP-FRT-medieret mitotisk rekombination, fjernes mutantceller fra vævet gennem c-Jun N-terminale kinase (JNK) -afhængig apoptose 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , ekstrudering 15 </suP> , 16 eller engulfment og fagocytose af naboer 17 . I denne genetisk mosaiske epithelia registreres apoptose for det meste i nTSG-mutante celler, der er placeret ved klongrænsen, hvilket tyder på, at tilstødende normale celler udløser apoptosen af nTSG-mutante celler 10 , 11 , 12 , 18 . Nylige undersøgelser i mammale celler har bekræftet, at denne cellekonkurrenceafhængige eliminering af pro-tumorceller er et evolutionært bevaret epithelial selvforsvarsmekanisme mod cancer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
En nylig undersøgelse i Drosophila- imaginale diske viste imidlertid, at mosaik-nTSG-knockdown-kloner inducerer neoplastiske tumorer i specifikkeIc regioner af vinge imaginal diske 16 . Indledende tumordannelse blev altid fundet i det perifere "hængsel" -område og observeret aldrig i den centrale "pose" -region i vingeskiveepitelet, hvilket tyder på, at det tumorgenetiske potentiale af nTSG-knockdown-celler afhænger af det lokale miljø. Den centrale pose region fungerer som en "tumor coldspot", hvor pro-tumor celler ikke viser dysplastisk overvækst, mens den perifere hængsel region opfører sig som en "tumor hotspot" 16 . I "coldspot" -poseregioner delaminerer nTSG-knockdown-celler fra basalsiden og gennemgår apoptose. I modsætning hertil, som "hotspot" hængselsceller har et netværk af robuste cytoskeletale strukturer på deres basale sider, delaminerer nTSG-knockdown-celler fra epitelens apikale side og initierer tumorigenisk overgrowth 16 . Derfor kræver analyse af tumorfænotyper i imaginal diske nøje konsistensDeration af den regionspecifikke modtagelighed for tumorigeniske stimuli.
Her beskriver vi en protokol til at inducere dannelse af neoplastisk tumor i Drosophila- fløjens imaginale diske, der anvender GAL4-UAS- RNAi- systemet, hvorved nTSG-knockdown-celler genereres i normal wing disc epithelia. Selv om disse eksperimentelle systemer er nyttige til at studere de tidlige stadier af kræft, er en klar klassificeringsmetode til evaluering af stadierne af tumorprogression i imaginal disc epithelia ikke blevet tydeligt beskrevet tidligere. Derfor foreslår vi også en diagnosemetode til klassificering af pro-tumor-klonale fænotyper induceret i vingeskiveepithelia i tre kategorier: hyperplasi (akkumulering af et for stort antal normale fremtrædende celler med forøget proliferation), dysplasi (præalignant væv sammensat af abnormt forekommende Celler) og neoplasi (godartet eller ondartet tumor sammensat af celler med et unormalt udseende og unormalt proliferationsmønster).
Protocol
Representative Results
Discussion
GAL4-UAS-systemet er et af de mest kraftfulde genetiske værktøjer til målrettet genekspression i Drosophila 26 og letter i høj grad tumorcelleinduktion og -analyse in vivo 4 . Dette system muliggør dannelsen af kloner, der bærer knockdown af tumor-suppressorgener eller overekspression af onkogener inden for vildtype epithelvæv, en situation, der ligner meget de indledende stadier af humant cancer, hvor transformerede pro-tumorceller er omgive…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker J. Vaughen for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 og The Takeda Science Foundation Research Grant til YT
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
- Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
- Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
- Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
- Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
- Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -. M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
- Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
- Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
- Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
- Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
- Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
- Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
- Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
- Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
- Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Nakajima, Y. -. I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
- Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
